Diese Arbeit wurde unterstützt durch die National Science Foundation vergibt an A.S. (DEB #1427772, 1745411, 1750037).

1. kreuzen Sie Sammlung und Oberfläche Sterilisation
<ol><li>Durch Ziehen einer 1 m2 weiße Tuch über einen Tick-assoziierten Lebensraum, Entfernen von Zecken Zecken an Wirtsarten, oder Aufzucht im Labor15,16Zecken sammeln. Verwenden Sie feine Pinzette, um Zecken zu manipulieren und bei-80 ° c aufbewahren</li>
	<li>Zecken in die einzelnen PCR-Rohre und entfernen Oberflächenverunreinigungen durch Vortexen für 15 s sukzessive mit 500 μL von Wasserstoffperoxid (H2O2), 70 % Ethanol und DdH2O.</li>
	<li>Legen Sie die Zecken in einem neuen PCR-Röhrchen und an der Luft trocknen lassen.</li>
	<li>In diesem Rohr mechanisch stören Tick Gewebe durch Zerkleinern die Zecken mit einem Mörser und Stößel (in dieser Studie verwendet), mit kleinen Perlen in einen Wulst-Schläger oder die Zecke mit einem Skalpell auseinander schneiden.</li>
</ol>(2) DNA-Reinigung
<ol><li>Reinigen Sie die DNA aus einzelnen Zecken, gemäß die Anweisungen in den im Handel erhältlichen DNA-Extraktion Kit. Für ein Endvolumen von 100 μL eluieren. Hinweis: Siehe Abbildung 1 für eine Übersicht der Schritte 2,2-2,8. Alternative Extraktionsmethoden sind Phenol-Chloroform Extraktion17,18, Ethanol Niederschlag19oder Extraktion mit einem Komplexbildner Material20,21.</li>
	<li>Erfolgreiche DNA-Reinigung mit einem Fluorometer oder Spektralphotometer zu bestätigen. Verwenden Sie für Fluorometry 10 μL der DNA Schablone in einem 190 μL doppelsträngigen DNA-Assay. Die erwartete Rendite ist 0,1 bis 1,0 ng/μl22. Spektrophotometrie verwenden Sie 1 μl DNA Schablone in einer Nukleinsäure-Quantifizierung. Die erwartete A260/280 Verhältnis ist etwa 1,823.</li>
	<li>Wenn nicht sofort zu Verstärkung, speichern die Proben bei-20 ° C.</li>
</ol>3. 16 s rRNA-gen-Verstärkung
<ol><li>Einrichten der Amplifikate PCR in eine 27,5 μL Reaktion mit: 5 μL jeder Grundierung auf 1 μM; 12.5 μL des im Handel erhältlichen PCR-Mix; und 5 μl DNA extrahiert aus einzelnen Zecken bei einer Konzentration von 5 ng/μl. Hinweis: Verwenden Sie die folgenden Primer für die Amplifikation der hypervariablen V3-V4 Region der 16 s rRNA gen13: 5'--TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG--3', 5'--GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC--3'</li>
	<li>Rohre in einem Thermocycler programmiert für verschieben: eine erste Denaturierung bei 95 ° C für 3 min; 25 Zyklen 1) 95 ° c für 30 s, (2) 57 ° C für 30 s, (3) 72 ° C für 30 s; eine letzte Verlängerung bei 72 ° C für 5 min; und einen letzten Halt bei 10 ° C.</li>
	<li>Das erledigt die PCR ist, visualisieren Sie das PCR-Produkt durch das Laden von 4-6 μL/Probe auf einem 1,5 % Agarosegel. Suchen Sie nach einer Band bei 460 bp um Verstärkung zu bestätigen. Hinweis: Amplicon PCR-Produkt möglicherweise nicht auf dem Gel sichtbar wenn die probenkonzentration zu niedrig ist (< 10 ng). Grundierung Dimer Anwesenheit ist häufig in geringer Konzentration Proben. Wenn andere nicht-Zielorganismen Bands vorhanden sind, passen Sie die Anlasstemperatur oder verringern Sie die Anzahl der Zyklen.</li>
	<li>Wenn nicht sofort zu Reinigung, speichern Sie die Proben bei 4 ° c</li>
</ol>(4) 16 s Amplikons Reinigung
<ol><li>Mit einem neuen PCR-Schlauch für jede Probe, kombinieren Sie das PCR-Produkt mit DdH2O 60 μL insgesamt zu erhalten. Führen Sie für Proben mit geringer DNA-Konzentrationen PCR Amplifikate in dreifacher Ausfertigung zu reduzieren Verstärkung Voreingenommenheit und bündeln die Proben zu konzentrieren.</li>
	<li>Raumtemperatur und Wirbel, die sie vor dem Gebrauch gut verleihen Sie PARAMAGNETISCHE Perlen.</li>
	<li>60 μl der Probe 48 μL der paramagnetischen Beads hinzufügen und 5 min. Platz die Rohre auf einem magnetischen Gestell für 5 min bis Lösung wird klar inkubieren. Den überstand zu entfernen. Hinweis: Diese Perle Konzentration zielt auf die Beseitigung der Grundierung Dimere (< 60 bp). Passen Sie ggf. die Wulst-Konzentration um andere unspezifische Streifenbildung zu entfernen.</li>
	<li>Mit Röhren auf magnetische Gitter hinzufügen 500 μL von frisch zubereiteten 80 % EtOH. Sofort nachdem alle Röhren EtOH hinzugefügt, pipette Flüssigkeit. Entfernen Sie nicht die Perlen. Die EtOH hinzufügen und entfernen noch einmal zu wiederholen.</li>
	<li>An der Luft Trocknen der Proben um überschüssige EtOH durch offengelassen die Rohre auf dem magnetischen Rack für 5 Minuten, oder bis kleine Risse sichtbar in die Perlen sind zu entfernen.</li>
	<li>Fügen Sie 20 μl TE-Puffer und inkubieren Sie die Proben aus der Magnet bei Raumtemperatur für ca. 5-10 min.</li>
	<li>Setzen Sie die Rohre wieder auf den Magneten. Sobald die Perlen und Flüssigkeit getrennt werden, übertragen des Überstands zu einem frischen Schlauch der gereinigte PCR-Produkt zu erhalten.</li>
	<li>(Optional) Visualisieren Sie das Produkt bestätigen erfolgreiche Amplikons Reinigung durch das Laden von 4-6 μL/Probe auf einem 1,5 % Gel. 460 bp-Band sollte sichtbar sein, und es dürfen keine Grundierung-Dimer.</li>
	<li>Wenn nicht sofort zum Index PCR Verfahren, speichern Sie die Proben 4 ° C.</li>
</ol>5. Probieren Sie Barcoding und Reinigung
<ol><li>Jede Probe weisen Sie einzigartige Grundierung Kombinationen auswählen, entweder vorwärts oder rückwärts Primer, oder beides, aus einem handelsüblichen Bibliothek Index Bausatz zu. Hinweis: Eindeutig beschriften Proben kann zur Differenzierung nach Sequenzierung. Kits bieten in der Regel genügend Primer um 96-384 Proben zu sequenzieren.</li>
	<li>Proben mit PCR in eine 25 μL Reaktion mit 2,5 μL jeder Grundierung (N7xx und S5xx), 12,5 μL der im Handel erhältlichen PCR master-Mix, 5 μL der DdH2O und 2,5 μL der gereinigten Amplikons Produkt zuordnen Sie der dual Primer oder Indizes.</li>
	<li>Die Rohre in einem Thermocycler programmiert für verschieben: eine erste Denaturierung bei 95 ° C für 3 min; 8-14 Zyklen 1) 95 ° c für 30 s, (2) 55 ° C für 30 s, (3) 72 ° C für 30 s; eine letzte Verlängerung bei 72 ° C für 5 min; und einen letzten Halt bei 10 ° C.</li>
	<li>Das erledigt die PCR ist, visualisieren Sie das PCR-Produkt durch das Laden von 4-6 μL/Probe auf einem 1,5 % Agarosegel. Suchen Sie nach einer Band bei 550 bp um Verstärkung zu bestätigen. Hinweis: Verwenden Sie die Visualisierung Ergebnisse Index PCR Radfahren Bedingungen zu informieren. Senken Sie die Zyklenzahl zu unspezifischen Bindung verringern oder erhöhen Sie die Anzahl der Zyklus um sichtbare Bänder für jede Probe zu erhalten.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Aufräumarbeiten, in Schritt 4 aufgeführt. Zur Vermeidung von Verdünnung während der Aufräumarbeiten durchführen Sie Index PCR in zweifacher Ausfertigung und bündeln Sie das Produkt hier.</li>
	<li>Wenn nicht sofort zu Bibliothek Quantifizierung und Normalisierung, speichern Sie die Proben bei 4 ° C.</li>
</ol>6. Bibliothek Quantifizierung und Normalisierung
<ol><li>Die Konzentration der einzelnen gereinigten, Barcode-Produkte aus Schritt 5.5 mit einem Fluorometer oder Spektralphotometer zu schätzen (siehe Punkt 2.2). Verdünnen Sie die Proben in TE-Puffer, Konzentrationen von ca. 13:00 zu erhalten. Hinweis: Bibliothek Quantifizierung ist notwendig, die Probe laden Konzentration empfohlen für die Sequenzierung Plattform zu erreichen. Bibliothek-Quantifizierung wird erreicht durch qPCR, sondern schätzen die probenkonzentration vor qPCR spart Zeit und Reagenzien. 13:00-Konzentration wird empfohlen, maximieren Sie die Genauigkeit der Bibliothek Quantifizierung, denn dies ist die mittlere Konzentration der qPCR-Standards in der Quantifizierung Kit24zur Verfügung gestellt.</li>
	<li>Führen Sie qPCR 6.0 μL qPCR-master-Mix (aus Bibliothek Quantifizierung Kit) 2.0 μl DdH2O und 2.0 μl der Probe oder Standard mit 10 μL Reaktion. Führen Sie jede Probe und standard in dreifacher Ausführung für höhere Genauigkeit und Präzision. Führen Sie jedes Beispiel auf drei oder mehr Verdünnung Ebenen (zB., 12:01, 1 Uhr und 22:00 für geschätzte ab Konzentrationen) um genaue Quantifizierung zu gewährleisten. Hinweis: Detaillierte Informationen über die zur Verfügung gestellten Grundierungen und Standards variieren basierend auf der Quantifizierung Kit verwendet und sind in den Datenblättern der Produkte zur Verfügung. Beziehen sich auf die Tabelle der Materialien für die Quantifizierung Kit in dieser Studie verwendet.</li>
	<li>Verschieben Sie die qPCR Platte oder Rohre zu einem Echtzeit-PCR-Instrument für programmiert: eine erste Denaturierung von 95 ° C für 5 min; 35 Zyklen 1) 95 ° c für 30 s und (2) 60 ° C für 45 s; und eine Dissoziation Schritt 1) 95 ° c für 15 s, (2) 60 ° C für 30 s und 3) 95 ° C für 15 s.</li>
	<li>Berechnen Sie den Mittelwert ab Konzentration für jede Probe mit der Quantifizierung Werte aus der qPCR-Ergebnisse und die Probe Verdünnung verwendet. Hinweis: zum Beispiel eine durchschnittliche Konzentration von 14:00 für eine Probe verdünnt 1: 100.000 ergibt eine original Start Konzentration von 200 nM. Wenn keiner der Verdünnung Ebenen für eine gegebene Probe innerhalb des Bereichs der standard Kurven liegt, können Quantifizierung Ergebnisse ungenau sein; in diesem Fall passen Sie die Verdünnung und durchführen Sie qPCR erneut.</li>
	<li>Jede gereinigten, Barcode-Probe 4 verdünnen nM in TE-Puffer, basierend auf den durchschnittlichen Konzentrationen in Schritt 7,5 berechnet. Hinweis: zum Beispiel für eine durchschnittliche probenkonzentration von 200 nM, verdünnte die Probe 01:50 in TE-Puffer 4 nM Konzentration zu erreichen. Die präzise probenkonzentration variiert je nach der Sequenzierung System und Reagenz-Kit verwendet. Finden Sie im Benutzerhandbuch Sequenzierung System für die empfohlenen Konzentration.</li>
	<li>Erstelle die kombinierte Bibliothek indem du gleiche Volumina (in der Regel 5 bis 10 μl) aller einzelnen Bibliotheken in ein einzelnes Rohr. Hinweis: wie alle Proben in einer 4 nM-Konzentration sollte gleiche Volumina hinzufügen einen gleichen Konzentration aller Proben in der gepoolten Bibliothek erreicht.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 6.2-6.4 auf der kombinierten Bibliothek, 4 nM-Konzentration zu bestätigen.</li>
	<li>Die kombinierte Bibliothek Konzentration berechnen und verdünnen oder neu bilden die endgültige, gepoolte Bibliothek mit Tris-Puffer bei Bedarf um 4 zu erreichen nM.</li>
	<li>Wenn nicht sofort zu probenbeladung, speichern die Proben bei-20 ° C. Führen Sie die Sequenzierung laufen kurz nach Quantifizierung, Verlust oder Änderungen an DNA-Konzentration während der Lagerung zu minimieren.</li>
</ol>(7) Bibliothek Denaturierung und Verdünnung und Sequenzierung (am selben Tag durchführen)
<ol><li>Die 4 nM kombinierte Bibliothek aus Schritt 6,9 mit NaOH zu denaturieren. Hinweis: Diese letzte Bibliothek vorbereitende Schritte für jede Sequenzierung System variieren. Lesen Sie in der Sequenzierung System Bedienungsanleitung für mehr detaillierte und aktualisierte Protokolle. Neue Benutzer müssen wahrscheinlich auf die Nutzung der Plattform Sequenzierung ausgebildet werden oder können ihre Bibliotheken zu einer Kern-Sequenzierung-Anlage senden.</li>
	<li>Verdünnen der denaturierten Bibliothek, um die gewünschte Belastung Konzentration mit Hilfe des Puffers in der Sequenzierung Reagenz-Kit (Table of Materials) zur Verfügung gestellt. Hinweis: Optimale Beladung Konzentrationen variieren je nach Sequenzierung System und in der Regel reichen von 1-250 pM25.</li>
	<li>Denaturieren Sie und verdünnen Sie die Sequenzierung Kontrolle. Hinweis: Hinzufügen eines Steuerelements Sequenzierung für Sequenzierung Probleme, die aus niedrigen Vielfalt Bibliotheken korrigiert. Denaturieren Sie die Sequenzierung Steuerung mit NaOH und verdünnen Sie, die gleiche Konzentration wie die Bibliothek.</li>
	<li>Kombinieren Sie die Bibliothek und Sequenzierung Kontrolle. Hinweis: Das Verhältnis der Sequenzierung Kontrolle kombinierte Bibliothek hängt die Bibliothek Vielfalt und Sequenzierung System verwendet, aber es ist in der Regel 1:1-26.</li>
	<li>Laden Sie die kombinierte Bibliothek und Sequenzierung Kontrolle Mischung auf die Sequenzierung Durchflusszelle.</li>
</ol>8. Amplikons Sequenzanalyse
<ol><li>Bewerten Sie den Gesamterfolg des Laufs durch die Untersuchung der laufen Metriken auf die Cloud-computing-Umgebung entspricht der Sequenzierung System verwendet. Hinweis: Die laufen Metriken, wie z.B. Anzahl der Sequenzierung liest, variiert je nach Sequenzierung Plattform und Reagenz-Kit verwendet. Zielwerte für gängige Sequenzierung Systeme sind in Tabelle 1aufgeführt.</li>
	<li>Laden Sie die rohen Sequenzierungsdaten und gewünschte Bioinformatik open-Source Software, Quantitative Einblicke in mikrobiellen Ökologie (QIIME)27 oder Mothur28. Hinweis: Beide QIIME und Mothur sind Open Source und kostenlos zum Download bereit. Detaillierte Anweisungen zur Verwendung dieser Programme können online eingesehen werden und sind für erstmalige Nutzer ausreichend detailliert. Die folgenden Schritte geben einen umfassenden Überblick über eine Bioinformatik-Pipeline in QIIME durchgeführt. Vertrautheit mit Python ist nicht notwendig, aber erleichtert die Umsetzung der folgenden Skripte</li>
	<li>Erstellen und Validieren der Zuordnungsdatei verwenden das Skript "validate_mapping_file.py" in QIIME. Hinweis: Die Zuordnungsdatei enthält alle Metadaten, die Datenanalyse, einschließlich Proben-ID, Amplifikate Grundierung Sequenzen und Beispielbeschreibung durchführen. Der Überprüfungsschritt prüft, ob alle erforderliche Daten in das richtige Format eingegeben wurden.</li>
	<li>Demultiplex und Filtern von Sequenzen mit dem Skript "split_libraries.py" (Abbildung 1). Hinweis: Dieses Skript weist Barcodes liest zu Proben, basierend auf der Index-Grundierung-Kombinationen und Probe-IDs geben Sie in der Zuordnungsdatei. Es führt auch mehrere Qualität Filtern Schritte zur Kontrolle für die Sequenzierung Fehler basierend auf benutzerdefinierten trenngrenzen für minimale Qualitätsfaktor, Sequenz Längen und Ende trimmen.</li>
	<li>Sequenzen mit dem Skript "pick_open_references_otus.py" weisen Sie operative taxonomische Einheiten (OTUs zu). Hinweis: In diesem Schritt werden Sequenzen gegen eine Referenzsammlung Sequenz basierend auf einem Schwellenwert der Identität (in der Regel 97 %) zusammengefasst. Liest, die die Referenz-Sequence-Auflistung nicht übereinstimmen, werden gegeneinander zusammengefasst. De Novo und geschlossen-Referenz OTU Kommissionierung Optionen sind auch verfügbar, aber Open-Referenz Kommissionierung von QIIME Entwickler empfohlen.</li>
	<li>Normalisieren Sie die OTU-Tabelle mithilfe des Skripts "alpha_rarefaction.py" oder "normalize_table.py". Hinweis: Dieser Schritt korrigiert für Variation in Spalte Summen oder gesamtsequenz liest pro Probe, die durch moderne Sequenziertechnologien entstehen. Normalisierung kann mit traditionellen Verdünnung durchgeführt werden oder durch alternative Methoden wie z. B. die kumulative Summe Skalierung.</li>
	<li>Führen Sie mehrere Alpha-Diversität, Beta-Diversität und taxonomische Zusammensetzung Vielfalt Analysen auf einmal mit dem "core_diversity_analysis.py"-Skript. Hinweis: Alternativ diese Analysen können ausgeführt werden separat mit der einzelnen Scripte (z. B. "alpha_diversity.py").</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Sequenzierung der nächsten Generation der 16 s rRNA geworden eine Standardmethode für die mikrobielle Identifizierung und aktiviert die Studie wie Vektor mikrobiome Erreger-Übertragung auswirken. Die hier beschriebene Protokoll beschreibt die Verwendung dieser Methode zu untersuchen, mikrobielle Gemeindeversammlung in I. Pacificus, ein Vektor-Arten für Lyme-Borreliose; Allerdings kann es leicht angewendet werden, um andere Zeckenarten oder Arthropoden Vektor Arten zu studieren.
In...

Das Wiederaufleben und Verbreitung von vektorübertragenen Krankheiten in den letzten Jahrzehnten Bedrohung eine ernsthafte für globale Gesundheit von Mensch und Natur. Wirksame Impfstoffe fehlen für die meisten dieser Krankheiten, und Bemühungen sind durch die komplexe biologische Natur der Vektoren und Vektor-Wirt Interaktionen behindert. Verständnis der Rolle der mikrobielle Wechselwirkungen innerhalb eines Vektors bei der Übertragung der Erreger können für die Entwicklung von neuen Strategien, die diese Herausforderungen umgehen. Insbesondere müssen die Wechselwirkungen zwischen Vektor-assoziierten mikrobielle Kommensalen, Symbionten und Krankheitserreger, genannt das Mikrobiom wichtige Konsequenzen für die Übertragung der Erreger. Überwältigende Beweise jetzt unterstützt diese Behauptung mit Beispiele, die zeigen einer Verbindung zwischen dem Vektor Mikrobiom und Kompetenz für Krankheiten wie Malaria, Zika-Virus und Lyme-Borreliose1,2,3. Allerdings erfordert die Umsetzung dieser Erkenntnisse in Strategien zur Seuchenbekämpfung weit mehr Detailwissen über die Struktur, Funktion und Herkunft der Vektor mikrobiome. Identifizierung und Charakterisierung der mikrobiellen Gemeinschaft unter unterschiedlichen ökologische und experimentellen Bedingungen Vektor bilden einen wichtigen Weg in die Zukunft in diesem Bereich.
Ein Verfahren zur Identifizierung von mikrobiellen Bewohner eines Vektors Erreger erfolgt hier durch die Verwendung von westlichen schwarzen Beinen Zecke, Ixodes Pacificus, eine Vektor-Spezies von der Lyme-Borreliose-Erreger Borrelia Burgdorferi. Während Zecken mehr Arten von menschlichen Krankheitserreger als andere Arthropoden Hafen, ist relativ wenig über die Biologie und Gemeinschaft Ökologie der Tick mikrobiome4bekannt. Es ist offensichtlich, dass Zecken beherbergen eine Vielzahl von Viren, Bakterien, Pilze und Protozoen die Kommensalen, Endosymbionts und transiente mikrobiellen Bewohner5,4enthalten. Vorherige Arbeit hat gezeigt, dass starke Schwankungen der Ixodes mikrobiome Geographie, Spezies, Geschlecht, Lebensphase und Blutmehl Quelle6,7,8zugeordnet. Jedoch die Mechanismen, die diese Variante unbekannt bleiben und detailliertere Untersuchungen über den Ursprung und Montage dieser mikrobiellen Gemeinschaften zu rechtfertigen. Zecken können Mikroben durch vertikale Übertragung erwerben Kontakt mit Gastgebern und Aufnahme aus der Umgebung durch die Luftlöcher, Mund und anal Pore9. Verständnis der Faktoren, die Gestaltung der Ausbildung und Entwicklung der Zecke Mikrobiom, ist speziell der relative Anteil der vertikalen und ökologischen Übertragung, wichtig für das Verständnis der natürlichen Muster und Variationen in tick Microbiome Vielfalt und wie interagieren diese Gemeinschaften während der Übertragung der Erreger, mit möglichen Anwendungen, Krankheit oder Vektor-Steuerung.
Leistungsstarke Molekulare Techniken, wie Next Generation Sequencing, jetzt zur Identifizierung von mikrobieller Gemeinschaften existieren und können eingesetzt werden, um Vektor mikrobiome unter verschiedenen Umwelt- oder experimentellen Bedingungen zu charakterisieren. Vor dem Aufkommen dieser Hochdurchsatz-Sequenzierung Ansätze die Identifizierung von Mikroben stützte sich überwiegend auf Mikroskopie und Kultur. Während Mikroskopie eine schnelle und einfache Technik ist, sind morphologische Methoden zur Identifizierung von Mikroben von Natur aus subjektiv und grob und begrenzt durch geringe Empfindlichkeit und Erkennung10. Kultur-basierte Methoden sind im großen und ganzen für mikrobielle Identifizierung verwendet und können zur Anfälligkeit von Mikroben für Droge-Behandlungen-11zu ermitteln. Allerdings leidet diese Methode auch geringe Empfindlichkeit, wie es hat geschätzt, dass weniger als 2 % der ökologischen Mikroben in einem Labor Einstellung12kultiviert werden können. Histologische Färbung Ansätze sind auch eingesetzt worden, zu erkennen und bestimmte Mikroben innerhalb von Vektoren zu lokalisieren, Untersuchungen von verschiedenen Taxa Ausschüttungen innerhalb der Zecke zu aktivieren und Hypothesen über mikrobielle Wechselwirkungen zu studieren. Allerdings sind Vorkenntnisse der mikrobiellen Identität für die Auswahl der geeigneten Flecken, was diesen Ansatz ungeeignet für mikrobielle Charakterisierung und Identifizierung erforderlich. Darüber hinaus histologische Färbung ist eine sehr zeitaufwendige und mühsame Prozess und skaliert nicht gut für große Probenmengen. Traditionelle Molekulare Ansätze wie Sanger-Sequenzierung sind ähnlich in ihrer Empfindlichkeit und Erkennung von verschiedenen mikrobiellen Gemeinschaften begrenzt.
Sequenzierung der nächsten Generation ermöglicht die schnelle Identifizierung von Mikroben aus einer großen Anzahl von Proben. Das Vorhandensein von standard Markergene und Referenz Datenbanken weitere ermöglicht verbesserte taxonomische Auflösung oft auf die Gattung oder Art. Kleinen Untereinheit ribosomalen RNAs sind häufig verwendet, um dieses Ziel zu erreichen mit 16 s rRNA ist die am häufigsten aufgrund des Vorhandenseins von konservierten und Variable Regionen innerhalb des Gens, so dass für die Erstellung von universellen Primer mit einzigartigen Amplifikate für jede bakterielle Art13,14. Dieser Bericht beschreibt ein Verfahren zur Identifizierung von Taxa in der Zecke Microbiome durch 16 s rRNA Next Generation Sequencing. Dieses Protokoll betont insbesondere die Schritte bei der Vorbereitung von Proben für die Sequenzierung. Mehr Details über die Sequenzierung verallgemeinert und Bioinformatik Schritte vorgesehen sind, da gibt es eine Vielzahl von Plattformen Sequenzierung und Analyse-Programme verfügbar, jeweils mit umfangreicher Dokumentation. Die Machbarkeit dieses Ansatzes Next Generation Sequencing zeigt eine Untersuchung der mikrobiellen Gemeindeversammlung innerhalb eine wichtige Krankheit Vektor zuweisen.

<table><tbody><tr><td>Item</td><td>Name of Material/Equipment</td><td>Company</td><td>Catalog #</td></tr><tr><td>1</td><td>DNeasy Blood &amp;amp; Tissue Kit</td><td>Qiagen</td><td>69504</td></tr><tr><td>2</td><td>Qubit 4 Fluorometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q3326</td></tr><tr><td>3</td><td>NanoDrop 8000 Spectrophotometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-8000-GL</td></tr><tr><td>4</td><td>2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK2501</td></tr><tr><td>5</td><td>AMPure XP beads</td><td>Agen Court</td><td>A63880&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>6</td><td>Magnetic Rack</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MR02</td></tr><tr><td>6</td><td>TE buffer</td><td>Teknova</td><td>T0223</td></tr><tr><td>7</td><td>Nextera Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-121-1011</td></tr><tr><td>8</td><td>KAPA Library Quantification Kit</td><td>Roche</td><td>KK4824</td></tr><tr><td>9</td><td>MiSeq System</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td></tr><tr><td>10</td><td>MiSeq Reagent Kit v3&amp;nbsp;</td><td>Illumina</td><td>MS-102-3001</td></tr><tr><td>11</td><td>10 mM Tris-HCl with 0.1% Tween 20</td><td>Teknova</td><td>T7724</td></tr></tbody></table>

tick microbiome characterization by next-generation 16s rrna amplicon sequencing

In den letzten Jahrzehnten haben vektorübertragene Krankheiten wieder aufgetaucht und mit alarmierender Rate, wodurch erhebliche Morbidität und Mortalität weltweit ausgebaut. Effektive und allgemein verfügbaren Impfstoffe sind für einen Großteil dieser Erkrankungen erfordern die Entwicklung von neuartigen Krankheit Minderungsstrategien fehlen. Zu diesem Zweck beinhaltet eine vielversprechende Möglichkeit der Seuchenbekämpfung targeting Vektor Mikrobiom, die Gemeinschaft der Mikroben bewohnen den Vektor. Der Vektor Microbiome spielt eine Schlüsselrolle in der Erreger Dynamik und Manipulationen das Mikrobiom zu reduzierten Vektor Fülle oder Erreger-Übertragung für eine Handvoll vektorübertragene Krankheiten geführt haben. Allerdings erfordert die Umsetzung dieser Erkenntnisse in Krankheit Steuer-und Regelanwendungen ein gründliches Verständnis der Vektor mikrobielle Ökologie, historisch durch unzureichende Technologie in diesem Bereich begrenzt. Das Aufkommen der Next Generation Sequencing Ansätze hat schnelle, hochparallele Sequenzierung von verschiedenen mikrobiellen Gemeinschaften ermöglicht. Ausrichtung auf das hoch konserviert 16 s rRNA-gen hat Charakterisierungen von Mikroben in Vektoren unter unterschiedlichen ökologische und experimentellen Bedingungen erleichtert. Diese Technik beinhaltet die Verstärkung der 16 s rRNA-gen, Probe Barcoding über Laden Proben auf einer Durchflusszelle für die Sequenzierung, PCR und Bioinformatik Ansätze Sequenzdaten phylogenetische Informationen übereinstimmen. Art oder Gattung-Ebene Kennung für eine hohe Anzahl von Wiederholungen kann in der Regel durch diesen Ansatz, damit umgehen Herausforderungen mißraten Entdeckung, Auflösung und Ausgabe von traditionellen Kultivierung, Mikroskopie oder histologische Färbung erreicht werden Techniken. Daher ist diese Methode eignet sich gut für die Charakterisierung von Vektor Mikroben unter unterschiedlichen Bedingungen aber kann nicht aktuell informieren über mikrobielle Funktion, Stelle innerhalb des Vektors oder Reaktion auf Antibiotika-Behandlung. Insgesamt ist 16 s Next Generation Sequencing eine leistungsfähige Technik für die Identität und Rolle der Vektor Mikroben in der Dynamik der Krankheit besser zu verstehen.

Insgesamt 42 Zecken aus drei separaten Ei Kupplungen und zwei Umweltexposition Perioden 0 und 2 Wochen im Boden für die Sequenzierung Microbiome verarbeitet wurden. Jeder Behandlungsgruppe, als ein einziges Kupplung und Belichtung Mal enthalten 6-8 Tick Proben zu replizieren. Diese verarbeiteten Tick-Extrakte wurden auf einer nächsten Generation Sequenzer geladen und ergab 12,885,713 gepaart Ende liest Filter übergeben. Waren in diesem Lauf 3 Negativkontrollen aus dem Extraktionsschrit...

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Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

Hier präsentieren wir ein Next Generation Sequencing-Protokoll für die 16 s rRNA-Sequenzierung die Identifizierung und Charakterisierung mikrobieller Gemeinschaften in Vektoren ermöglicht. Bei dieser Methode wird die DNA-Extraktion, Amplifikation und Barcoding der Proben durch PCR, Sequenzierung auf eine-Durchflusszelle und Bioinformatik Sequenzdaten phylogenetische Informationen übereinstimmen.

Tick Microbiome Charakterisierung von Next-Generation-16 s rRNA Amplikons Sequenzierung

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

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12.8K Aufrufe.  San Francisco State University. Hier präsentieren wir ein Next Generation Sequencing-Protokoll für die 16 s rRNA-Sequenzierung die Identifizierung und Charakterisierung mikrobieller Gemeinschaften in Vektoren ermöglicht. Bei dieser Methode wird die DNA-Extraktion, Amplifikation und Barcoding der Proben durch PCR, Sequenzierung auf eine-Durchflusszelle und Bioinformatik Sequenzdaten phylogenetische Informationen übereinstimmen.

Serie: Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

Die Wurzel Mikrobiom zu erkunden: Extrahieren von Bakteriengemeinschaft Daten aus dem Boden, die Rhizosphäre und die Wurzel Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Forschung

Genetik

A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples

Studies of microbial communities have become widespread with the development of relatively inexpensive, rapid, and high throughput sequencing. However, as with all these technologies, reproducible results depend on a laboratory workflow that incorporates appropriate precautions and controls. This is particularly important with low-biomass samples where contaminating bacterial DNA can generate misleading results. This article details a semi-automated workflow to identify microbes from human breast milk samples using targeted sequencing of the 16S ribosomal RNA (rRNA) V4 region on a low- to mid-throughput scale. The protocol describes sample preparation from whole milk including: sample lysis, nucleic acid extraction, amplification of the V4 region of the 16S rRNA gene, and library preparation with quality control measures. Importantly, the protocol and discussion consider issues that are salient to the preparation and analysis of low-biomass samples including appropriate positive and negative controls, PCR inhibitor removal, sample contamination by environmental, reagent, or experimental sources, and experimental best practices designed to ensure reproducibility. While the protocol as described is specific to human milk samples, it is adaptable to numerous low- and high-biomass sample types, including samples collected on swabs, frozen neat, or stabilized in a preservation buffer.

A semi-automated workflow is presented for targeted sequencing of 16S rRNA from human milk and other low-biomass sample types.

Eine Methode zur gezielten 16 s Sequenzierung des menschlichen Milchproben

Studies of microbial communities have become widespread with the development of relatively inexpensive, rapid, and high throughput sequencing. However, as ...

Immunologie und Infektion

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the subcellular distribution of a specific tagged fluorescent marker in the secretory pathway. Arabidopsis is a powerful biological model for genetic studies because of its genome size, generation time, and conservation of molecular mechanisms among kingdoms. The array genotyping as an approach to map the mutation in alternative to the traditional method based on molecular markers is advantageous because it is relatively faster and may allow the mapping of several mutants in a really short time frame. This method allows the identification of proteins that can influence the integrity of any organelle in plants. Here, as an example, we propose a screen to map genes important for the integrity of the endoplasmic reticulum (ER). Our approach, however, can be easily extended to other plant cell organelles (for example see1,2), and thus represents an important step toward understanding the molecular basis governing other subcellular structures.

A fundamental quest in cell biology is to define the mechanisms that underlie the identity of the organelles that make eukaryotic cells. Here we propose a method to identify the genes responsible for the morphological and functional integrity of plant organelles using fluorescence microscopy and next-generation sequencing tools.

Fluoreszenz-Mikroskopie Screening und Next-Generation-Sequencing: Nützliche Tools für die Identifizierung von Genen in den Organellen Integrität beteiligt

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Biologie

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

Next-Generation-Sequenzierung der ribosomalen 16S-RNA Gene Amplikons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

Gezielte DNA Methylierungsanalyse von Next-Generation-Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplification, Next-Generation-Sequenzierung und genomischer DNA Mapping von Retrovirale Integration Seiten

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

Effiziente Nukleinsäure-Extraktion und 16S rRNA Gen-Sequenzierung für bakterielle Gemeinschaft Charakterisierung

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. Deviations from what is considered a healthy microbiota composition (dysbiosis) may impair vital functions leading to pathologic conditions. Recent and ongoing research efforts have been directed toward the characterization of associations between microbial composition and human health and disease.
Advances in high-throughput sequencing technologies enable characterization of the gut microbial composition. These methods include 16S rRNA-amplicon sequencing and shotgun sequencing. 16S rRNA-amplicon sequencing is used to profile taxonomical composition, while shotgun sequencing provides additional information about gene predictions and functional annotation. An advantage in using a targeted sequencing method of the 16S rRNA gene variable region is its substantially lower cost compared to shotgun sequencing. Sequence differences in the 16S rRNA gene are used as a microbial fingerprint to identify and quantify different taxa within an individual sample.
Major international efforts have enlisted standards for 16S rRNA-amplicon sequencing. However, several studies report a common source of variation caused by batch effect. To minimize this effect, uniformed protocols for sample collection, processing, and sequencing must be implemented. This protocol proposes the integration of broadly used protocols starting from fecal sample collection to data analyses. This protocol includes a column-free, direct-PCR approach that enables simultaneous handling and DNA extraction of large numbers of fecal samples, along with PCR amplification of the V4 region. In addition, the protocol describes the analysis pipeline and provides a script using the latest version of QIIME (QIIME 2 version 2017.7.0 and DADA2). This step-by-step protocol is aimed to guide those interested in initiating the use of 16S rRNA-amplicon sequencing in a robust, reproductive, easy to use, detailed way.

This manuscript describes a detailed standardized protocol of high-throughput 16S rRNA-amplicon sequencing. The protocol introduces an integrated, uniformed, feasible, and inexpensive protocol starting from fecal sample collection through data analyses. This protocol enables analysis of large numbers of samples with rigorous standards and several controls.

Geführte Protokoll für fäkale mikrobielle Charakterisierung von 16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

Mikrobiota-Analyse mit zweistufiger PCR- und 16S-rRNA-Gensequenzierung der nächsten Generation

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

16S rRNA Sequencing: A PCR-based Technique to Identify Bacterial Species

Source: Ewa Bukowska-Faniband1, Tilde Andersson1, Rolf Lood1 
1 Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center, Lund University, 221 00 Lund, Sweden
Planet Earth is a habitat for millions of bacterial species, each of which has specific characteristics. Identification of bacterial species is widely used in microbial ecology to determine biodiversity of environmental samples and medical microbiology to diagnose infected patients. Bacteria can be classified using conventional microbiology methods, such as microscopy, growth on specific media, biochemical and serological tests, and antibiotic sensitivity assays. In recent decades, molecular microbiology methods have revolutionized bacterial identification. A popular method is 16S ribosomal RNA (rRNA) gene sequencing. This method is not only faster and more accurate than conventional methods, but also allows identification of strains that are difficult to grow in laboratory conditions. Furthermore, differentiation of strains at the molecular level enables discrimination between phenotypically identical bacteria (1-4).
16S rRNA joins with a complex of 19 proteins to form a 30S subunit of the bacterial ribosome (5). It is encoded by the 16S rRNA gene, which is present and highly conserved in all bacteria due to its essential function in ribosome assembly; however, it also contains variable regions which may serve as fingerprints for particular species. These features have made the 16S rRNA gene an ideal genetic fragment to be used in identification, comparison, and phylogenetic classification of bacteria (6).
16S rRNA gene sequencing is based on the polymerase chain reaction (PCR) (7-8) followed by DNA sequencing (9). PCR is a molecular biology method used to amplify specific fragments of DNA through a series of cycles that include:
i) Denaturation of a double stranded DNA template 
ii) Annealing of primers (short oligonucleotides) that are complementary to the template 
iii) Extension of primers by the DNA polymerase enzyme, which synthesizes a new DNA strand
A schematic overview of the method is shown in Figure 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10510/10510fig1.jpg" /> 
Figure 1: Schematic overview of the PCR reaction. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10510/10510fig1large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
There are several factors that are important for a successful PCR reaction, one of which is quality of the DNA template. Isolation of chromosomal DNA from bacteria can be performed using standard protocols or commercial kits. Special care should be taken to obtain DNA that is free of contaminants that can inhibit the PCR reaction.
Conserved regions of the 16S rRNA gene permit the design of universal primer pairs (one forward and one reverse) that can bind to and amplify the target region in any bacterial species. The target region can vary in size. While some primer pairs can amplify most of the 16S rRNA gene, others amplify only parts of it. Examples of commonly used primers are shown in Table 1 and their binding sites are depicted in Figure 2.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Primer name</td>
			<td>Sequence (5&#39;&#8594;3&#39;)</td>
			<td>Forward/ reverse</td>
			<td>Reference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8F b)</td>
			<td>AGAGTTTGATCCTGGCTCAG</td>
			<td>forward</td>
			<td>-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27F</td>
			<td>AGAGTTTGATCMTGGCTCAG</td>
			<td>forward</td>
			<td>-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>515F</td>
			<td>GTGCCAGCMGCCGCGGTAA</td>
			<td>forward</td>
			<td>-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>911R</td>
			<td>GCCCCCGTCAATTCMTTTGA</td>
			<td>reverse</td>
			<td>-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1391R</td>
			<td>GACGGGCGGTGTGTRCA</td>
			<td>reverse</td>
			<td>-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1492R</td>
			<td>GGTTACCTTGTTACGACTT</td>
			<td>reverse</td>
			<td>-11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1: Examples of standard oligonucleotides used in amplification of 16S rRNA genes a). 
a) The expected lengths of the PCR product generated using the different primer combinations can be estimated by calculating the distance between the binding sites for the forward and the reverse primer (see Figure 2), e.g. the size of the PCR product using primer pair 8F-1492R is ~1500 bp, and for primer pair 27F-911R ~900 bp. 
b) also known as fD1
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10510/10510fig2.jpg" /> 
Figure 2: Representative figure of the 16S rRNA sequence and the primer-binding sites. Conserved regions are colored in grey and variable regions are filled with diagonal lines. To allow for the highest resolution, primer 8F and 1492R (name based on location on rRNA sequence) are used to amplify the whole sequence, allowing for the sequencing of several variable regions of the gene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10510/10510fig2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
Cycling conditions for PCR (i.e. the temperature and time required for the DNA to be denatured, annealed with primers, and synthesized) are dependent on the type of polymerase that is used and the properties of the primers. It is recommended to follow the manufacturer&#39;s guidelines for a particular polymerase.
After the PCR program is completed, the products are analyzed by agarose gel electrophoresis. A successful PCR yields a single band of expected size. The product must be purified prior to sequencing to remove residual primers, deoxyribonucleotides, polymerase, and buffer which were present in the PCR reaction. The purified DNA fragments are usually sent for sequencing to commercial sequencing services; however, some institutions perform DNA sequencing at their own core facilities.
The DNA sequence is automatically generated from a DNA chromatogram by a computer and must be carefully checked for quality, as manual editing is sometimes needed. Following this step, the gene sequence is compared with sequences deposited in the 16S rRNA database. The regions of similarity are identified, and the most similar sequences are delivered.

16S rRNA Sequencing: Identifying Bacterial Species by PCR

16S rRNA-Sequenzierung: Eine PCR-basierte Technik zur Identifizierung bakterieller Arten

Source: Ewa Bukowska-Faniband1, Tilde Andersson1, Rolf Lood1
1 Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center, ...