Development of the method presented here has been carried out with various sources of funding, including Genome Canada and Genome Quebec, Environment Canada STAGE program and internal NRC funds.

フュージョン法による1の16SrRNA遺伝子アンプリコンライブラリの準備<ol><li>プライマー（フォワード、F343-IONA-MIDXX解凍：5&#39;-CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG AC T CAG XXX XXX XXX XTA CGG RAG GCA GCA G-3 &#39;;、R533-IonP1リバース：5&#39;-CCT CTC TAT GGG CAG TCG GTG AT A TTA CCG CGG CTG CTG GC-3 &#39;;ボールド：イオントレント特定のアダプター;斜体：シーケンシングの実行の開始時に信号強度を較正するためのキーであり、正規のフォント：鋳型特異的なプライマーであり、X ... X：10 bpのバーコード、いくつかのバーコード配列については表1を参照）、2倍HotStartTaqプラスマスターミックスとサンプル。穏やかに混合されるべきであるマスターミックスを除いて、使用前に十分に混合します。 </li><li>リバースプライマー0.5μM、0.4ウシ血清アルブミン（BSA）のmg / mlのおよび1×HotStartTaqプラスマスターミックスをPCRミックス（20μlの反応）を準備します。 Eにマスターミックス18.5μl添加ACH PCRチューブ。 </li><li>一緒に配列決定されるサンプルごとに異なる​​バーコードがフォワードプライマー（20mMの0.5μl）を追加します。 PCRチューブにサンプルを1μl（1-10 ngの/μl）を添加。 </li><li> PCR装置にチューブを配置し、次のプログラムを実行します。95℃で5分間初期変性; 45秒間、30秒、72℃30秒、55℃、95℃の25サイクル; 10分間72℃で最終伸長。 PCR産物を4℃に保っCO / Nまたは使用するまで凍結することができる。 </li></ol> 2アンプリコン精製、定量およびプーリング<ol><li>利用可能な最大の櫛を使用して、2％アガロースゲルを準備します。よく空の各試料を分離、ゲル上での反応や負荷に6×ゲルローディング色素5を添加する。 50分間70 Vでゲルを実行します。 </li><li>ゲルの写真を撮るとバンド（250bpの周りが期待サイズ：190 bpの産物を加えた63塩基対のアダプターおよびバーコード）を切断清潔なメスを使用しています。 </li><li&gt;は切除したバンドを計量し（ たとえばと、キアクイックゲル抽出キット）PCR産物のゲル抽出および精製を進める。 </li><li>ピコグリーンで各PCR産物を定量化し、5×10 9分子/μL（約1 ngの/μL）での保存溶液を得るために、希釈液を作る。いくつかのサンプルがより低い増幅を示された場合は、以降の操作に適した最低濃度は1.57×10 7分子/μL（26 PM）であることを念頭に置いて、より低い濃度に希釈液を調整します。 </li><li>希釈した各PCR産物のプール10μlのサンプルを、等モルのプールを得た。計画されたシーケンシングの実行ごとに1つの別のプールを準備します。使用するまで、プールされたPCR産物は、冷凍庫に保つことができる。 </li></ol> 3エマルジョンPCRおよびシーケンシング<ol><li>エマルジョンPCR法を実行します。 <ol><li> 25μlの容量で26 PMにプールされたPCR産物を希釈する。イオンPGMテンプレートキットからの試薬を解凍する。 </li><li>エマルジョンPCRミックスを調製する（キットに提供される試薬）をPCRフード内やベンチにプールされたPCR産物と球粒子（提供）を追加します。完全に混合し、フィルターカートリッジに混合物を挿入し、慎重に乳化油（付属）でトップ。 </li><li>ゆっくりと自動化されたエマルジ ​​ョンPCR装置（ 例えば、イオンワンタッチ2計器）上のフィルターカートリッジと負荷が逆になります。適切なプログラムを選択し、手順を開始する。 </li></ol></li><li> PCRが完了した自動化されたエマルションの後、採血管からの上清を除去し、チューブの底に球粒子を取り出す。 （キットに付属）洗浄溶液100μl中球を再懸濁し、ライブラリ定量化のための2.0μlのアリコートを取る。 </li><li>図書館定量化を実行します。 <ol><li>アダプターB&#39;-ファム2μlの（5&#39;-FAM -CTでSSPEバッファー（150mMのNaCl、10mMののNaPO 4、1mMの硫酸ナトリウム-EDTA）100μlをミックスG AGA CTG CCA AGG CAC ACA GGG GAT AGG-3 &#39;）プローブとアダプターA-Cy5を2μlの（5&#39;-Cy5の -CCAのTCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG-3&#39;）プローブ。ステップ3.2で撮影2.0μlのアリコートにこの混合物の52μLを加え、定量化のためのブランクとして残り52μlに（テンプレートキットから）の洗浄溶液2μlを加える。 </li><li> 2分間、次いで37℃で、2分間95℃でインキュベートする。 1.5ミリリットルチューブ内での混合物を転送します。 </li><li> RTで3分間15,500×gでTEX緩衝液（10mMのTris、1mMのEDTA、0.01％トリトンX-100、pH8.0）を1.0mlのは、ミックス遠心分離して下さい。上清を除去し、各チューブに20μlのままにしておきます。この洗浄操作を2回繰り返します。 </li><li> 、TEXバッファー180μl添加し、ペレット化した粒子を再懸濁し、500μlの量子ビットチューブに移す。 </li><li>量子ビット装置を用いて、FAMと​​Cy5用の蛍光を測定し、イオンコミュニティウェブサイトで利用可能な計算機を使用して、正球の割合を算出。 </li></ol></li><li>自動化された濃縮システム（ 例えば、イオンワンタッチエンリッチメント·システム）を使用して（増幅されたDNAを含む）は、正球について球粒子の残りを豊かにする。 <ol><li>提供さ8ウェルストリップの適切なウェルにおけるピペットで試薬：まあ1：ステップ3.2から球体粒子;さて2：予め洗浄のMyOneストレプトアビジンC1ビーズ（13μl）を;さて図3、図4および5：洗浄溶液（テンプレートキットで提供される）; 6さて：空;さて7：溶融オフ溶液（125 mMのNaOHを、0.1％のTween 20）;さて8：空。 </li><li>ピペッティングアームの先端と試料採取用の0.2ミリリットルチューブを取り付けます。楽器を起動します。濃縮の終了時に、溶液（提供）を中和する10μlのを追加します。濃縮されたビーズは、最大15日間4℃に保つことができる。 </li></ol></li><li>シークエンシング装置を初期化します。 <ol><li>シーケンシングの実行の詳細を指定して、シークエンシング機器に接続し、シーケンシングの実行計画を準備します。 </li><li> Installの洗浄溶液＃2（イオンPGM配列決定キットで提供される）、洗浄溶液＃1（350μlの100mMのNaOH）で、自動pH緩衝液（付属）。 </li><li>初期化手順を開始して、それぞれの50mlチューブでのdATP、dGTPをdCTP及びdTTPのヌクレオチド（提供）を追加メッセージが表示されたら。配列決定装置上にチューブをねじ込み、初期化手順を続行します。初期化が完了すると、すぐに実行手順を開始する。 </li></ol></li><li>配列決定のためのサンプルを準備し、チップをロードします。 <ol><li> 1.5分間15,500×gで遠心分離することにより、チューブの底にステップ3.4から濃縮球を収集します。正確に3μLを残して上清を取り除きます。 </li><li> （配列決定キットで提供される）の配列決定プライマーの3μl加え、粒子を再懸濁させ、上下にピペッティングすることによって十分に混合して。 2分間、次いで37℃で、2分間95℃でインキュベートする。 </li><li>ポリメラーゼ1μlの（付属）を追加し、よく混ぜincub5分間RTで食べた。 30分以内にシークエンシングチップ上の酵素球の混合物をロードするために進んでください。 </li><li>インキュベーションの間、シーケンサー上でシーケンシングチップをロードして、チップの品質チェックを行う。遠心分離することにより、チップから液体を取り出し、ゆっくりと酵素球ミックス（7μl）をダウンピペッティングとチップ内の気泡の導入を回避することにより、チップ内のサンプルをロードします。 </li><li>マイクロ遠心、1分間のチップを3回遠心します。各遠心分離、チップの向きを変更し、各実行間に上下にピペッティングして混ぜる。 </li><li>機器内のチップをロードし、実行を開始します。 </li></ol></li></ol> 4。基本シーケンスデータ解析<ol><li>配列データ·サーバに接続し、FASTQファイルをダウンロードします。 （ 表1の例を参照）プライマーおよびバーコード情報を含むタブ区切りの「オリゴ」ファイルを作成します。名言からGreengenes参照ファイルをダウンロードホ·ウェブサイト（ <a href="http://www.mothur.org/wiki/Taxonomy_outline">http://www.mothur.org/wiki/Taxonomy_outline</a> ）。 </li><li> Mothurを起動して、分析を実行します。 <ol><li>次のコマンドを使用して、FASTA及び品質ファイルにFASTQファイルを変換しますfastq.info（FASTQ = test.fastq） </li><li> 、trim.seqs（FASTA = test.fasta、オリゴ= barcode.txt、qfileにより= test.qual、qwindowaverage = 20、qwindowsize = 50、minlength = 150：各シーケンスのグループメンバーシップを決定し、次のコマンドを用いて配列をトリミングkeepforward = T） </li><li>さまざまなオプションが所望のストリンジェンシーに応じて変更することができる</li><li>次のコマンドを使用してgreengenes分類法における配列の分類：classify.seqs（FASTA = test.trim.fasta、方法=王、グループ= test.groups、テンプレート= gg_99_otus.fasta、分類学= gg_99_otus.tax、カットオフ= 50） </li></ol></li></ol>

<ol>
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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+alignment+quality,+distance+calculation+method,+sequence+filtering,+and+region+on+the+analysis+of+16S+rRNA+gene-based+studies.">The effects of alignment quality, distance calculation method, sequence filtering, and region on the analysis of 16S rRNA gene-based studies.</a> PLoS Comput. Biol. 6, e1000844 (2010).</li><li>Links, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chaperonin-60+universal+target+Is+a+barcode+for+bacteria+that+enables+de+novo+assembly+of+metagenomic+sequence+data.">The chaperonin-60 universal target Is a barcode for bacteria that enables de novo assembly of metagenomic sequence data.</a> PLoS ONE. 7, e49755 (2012).</li><li>Vos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+rpoB+and+16S+rRNA+as+markers+in+pyrosequencing+studies+of+bacterial+diversity.">Comparison of rpoB and 16S rRNA as markers in pyrosequencing studies of bacterial diversity.</a> PLoS ONE. 7, e30600 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html>ここで紹介する方法は、簡単で安価であり、多くの研究室が、メタゲノムシーケンシングの力にアクセスすることを可能にする必要があります。それが使用されるシーケンシングプラットフォームに応じて異なるが、一回のライブラリは、プロセスの大部分が自動化されていると非常に少ないハンズオン時間は、必要とされる構成されている。ここで使用されるシーケンシングプラットフォーム（イオントレントPGM）のために、完全な手順は、作業の2日以内に行うことができます。 36サンプルのPCR増幅：25ドル、ゲル精製および36サンプルのピコグリーンDNA定量：125ドルを、エマルジョンPCRは、1プールされたアンプリコン試料について、以下のように（2013年9月）を書いている時点では、上記の詳細な例に関連する試薬の費用であった：550ドルまたはサンプルあたり15ドルまたは品質フィルタリング読み取りあたり0.0015ドル、合計250ドル、$ 150と配列決定試薬。この価格は、機器、サービス契約、機器の減価償却費、技術者の給与および実験室スペースの使用は含まれていません。 10トン &quot;&gt;最も重要なステップの一つは、ピコグリーン定量化は、ここで使用された。試料のそれぞれのために読み込みますが、他の方法が適しているかもしれません、しかしあまり正確で同様の数を取得するために、等モル比ですべての製品をプールすることである（ 例えば、UV定量、ゲルベースの定量化）。どんなに正確な定量とプーリングを行うことによって、ある程度の変動は、サンプル当たりの読取りの数が存在し、 表2に詳細に典型的な実験では、4,380から32,750の範囲であるサンプル（40〜50以上）の多数を処理した場合、10338の平均読み出すとともに、単一列のゲル精製、厳しいサイズカットオフ（ 例えば、AMPureビーズ）を有するビーズを用いてプレートまたは精製ゲル精製によって置き換えることができる読み取り。 現在までに、16S rRNA遺伝子のために最も使用される次世代シークエンシング技術は、このプロトコルで使用される454ザ·イオン·トレントシークエンシング技術は、概念的に非常に似てい454へと両方の技術は、配列決定エラーの同じタイプの傾向がある。当然のことながら、それはイオントレントシーケンシングは、454 10に非常に類似の配列決定の結果をもたらしたことが示された。最近では、多くの研究者は、16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンシング18,19のためのイルミナ技術の使用を検討している。いずれの場合も、この方法で最近記載のように、これらの配列決定技術のために必要なアダプタとバーコードと一致するように融合プライマー配列を変更することにより、イルミナMiSeqまたは454 GSジュニアのような他のベンチトップのシーケンサーのための現在のプロトコルを適合させることが容易であるイルミナMiSeq 19。代わりに、研究者は、手順1と、ここで詳細なプロトコルの2に従い、エマルジョンPCRおよび配列決定が実行されるであろうシーケンシングセンターにプールされたアンプリコンを送信することができます。 16S rRNA遺伝子をトリミングし、分類されたMothurを使用して、他の多くの分析が上に行うことができますし、読み取り16S rRNA遺伝子アンプリコン。例えば、ベータ多様性で概説した手順を用いて、各サンプルペア間Unifrac距離を計算することによって評価することができる<a href="http://unifrac.colorado.edu/">http://unifrac.colorado.edu/</a> 20。アルファ多様性指数と、各サンプルの操作分類学的単位の数はAmpliconNoise 21のようQIIME内のツールを使用して、またはHuse らによって概説された手順を用いて算出することができる。22とMothur内で利用できる。 ここで使用したプライマーは、16S rRNA遺伝子の可変領域3及び4を増幅したが、他の多くの領域が標的化され得る。本研究では、16S rRNA遺伝子は、植物材料から増幅し、プライマーの選択は、葉緑体16S rRNA遺伝子23,24の増幅を避けるために行われた。製品の長さ、分類学上のパワーと有用性25,26の任期が異なる利用可能な他のプライマー、多種多様があります。しかし、すべての場合において200-400 bpが確実に種レベルで分類することができない16S rRNA遺伝子の読み取り、および分析は、属、より高い分類学的レベルに制限されています。種レベル情報がCpn60ととのrpoB遺伝子27,28のように、必要な場合に他の遺伝子は、より適切である可能性があります。分析ツールのパワーシーケンシングおよび増加するコストの今後の大幅な滴が散弾銃のメタゲノミクスにより16S rRNA遺伝子シーケンシングを交換することが可能になるかもしれないが、それまでの16S rRNA遺伝子配列決定は、環境微生物学のゴールドスタンダードのまま。

それは、環境試料中に含まれる遺伝情報の全体を対象としてメタゲノム配列決定は、非常に強力な技術です。ショットガン配列決定、大インサートライブラリおよびアンプリコンシークエンシングを含むメタゲノムシーケンシングのさまざまなフレーバーがあります。アンプリコンシークエンシングは、比較的、安価で高速で生成することができるという利点は、一般的に整列させることができる、単一のゲノム領域から読み取り提供しています。また、アンプリコンの配列決定のためのデータ分析のワークフローは、ほとんど標準化されている。それはPCRに基づいているので、それはせいぜい、このアプローチは、半定量的になり、不完全特異性、不完全な被覆およびプライマー1,2を付勢する、に関連するすべてのバイアスを有している。いくつかのゲノム領域は、機能的遺伝子を含むアンプリコン配列決定のために標的とすることができるが、最も人気のあるオプションは、コミュニティプロファイルを生成するために、そのような16S rRNA遺伝子などのマーカー遺伝子を使用することである。伝統的に、16S rRNA遺伝子アンプリコンsequencingを大腸菌でクローニングを含め、労働集約的な技術を用いて実施した大腸菌 、コロニーピッキングと孤立プラスミド上サンガー配列決定に続いてプラスミド抽出し、、結果的に、ほとんどの研究は、サンプルあたり100未満のクローンを分析した。大規模な配列決定反応の並列化と、最も重要なのは、宿主内で遺伝子断片を挿入しなくても、テンプレートのクローンを分離：次世代シーケンシングは、2つの主要な進歩をもたらした。これは途方もなく、16S rRNAの遺伝子アンプリコンシークエンシング3のための「ルネサンス」で、その結果、すぐに戻って多くの環境微生物学研究のルーチン機能としてある16S rRNA遺伝子アンプリコンのシーケンシングを簡素化している。 2005 4ロシュ454シークエンシングの登場以来、いくつかの他の次世代シーケンシング技術が市場に登場している（ 例えば、イルミナ、ソリッド、PacBio）。より最近では、ベンチトップ配列の導入RSは、小さなラボに大シーケンシングセンターに一回の排他的シーケンシング能力をもたらした。ファイブ卓上マシンは現在入手可能である：454 GSジュニア、イオントレント個人ゲノムマシン（PGM）とプロトン、およびイルミナMiSeqとNextSeq 500これらすべてのシーケンサーはあまり提供していますが、ほとんどのフルよりも実行し、ドル当たり少ない拠点ごとに読み込むスケールのシーケンサは、彼らは迅速な、より柔軟であり、その低買収し、実行コストは小さな大学の研究室のために彼らは手頃な価格になります。研究のこのタイプは一般的に、配列決定の極端な深さを必要としないため、ベンチトップ·シーケンサーは、環境微生物学研究における小さなゲノムおよび低複雑メタゲノムシーケンシングアンプリコンに特に適している。例えば、それは一般的に、16S rRNA遺伝子配列決定研究のための数は、サンプルごとに読み取ることが合意されている〜1,000百万がデータセット5を読み込むのと同じパターンを生成することができます読み取るように、最優先事項ではありません。と言われたので、ベンチトップ次世代generatio<html> nはシーケンサはまだ〜10のGBP（イルミナMiSeq）〜10月15日のGBP（イオントレントプロトン）、〜2のGBP（イオントレントPGM）、〜35 Mbpの（454 GSジュニア）の最大収率で、シーケンス·大量のデータを生成するほとんどの環境微生物学研究のために十分以上のものですと〜100のGBP（イルミナNEXT SEQ 500）。 ベンチトップ型シーケンサーを用いて16S rRNAのアンプリコンの次世代シークエンシングは、近年、さまざまな環境に適用されている。例えば、イオン·トレントPGMは、コミュニティのために使用されているオイルサンドの炭化水素で汚染された北極土壌8,9の養殖システム7は 、再循環により、特に高いpH及び低い透過6を持っていたウラン鉱山尾鉱、採掘の影響を受ける堆積物の分析と汚染された土壌12に植え柳の根圏の、ヒトおよび動物の体の13〜16と嫌気性消化槽17のアサバスカ川10,11からバイオフィルム、。 この貢献私たちの具体的jove_content &quot;&gt;ベンチトップ次世代シーケンサー（イオントレントPGM）を使用して、社内で16S rRNA遺伝子アンプリコンを配列決定するために私たちのアプローチ。DNA抽出後、16S rRNA遺伝子が含まれているドメインレベルの細菌のプライマーを用いて増幅しているシークエンシングアダプターとユニークな、試料特異的配列（バーコード）。アンプリコンを精製し、等モル比で定量し、プールした。プールされたサンプルは、その後クローン的エマルジョンPCRで増幅され、配列決定されているが、得られた配列は、公的に利用可能なバイオインフォマティクスツールを用いて分析している（ たとえば、Mothur）。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="544">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">Reagent</td>
			<td style="width:145px;">Company</td>
			<td style="width:128px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Ion 314 Chip Kit v2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:128px;">4482261</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Ion PGM Sequencing 200 Kit v2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:128px;">4482006</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Ion PGM Template OT2 200 Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:128px;">4480974</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HotStarTaq Plus Master Mix Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>203646</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primers and probes</td>
			<td style="width:145px;">IDT</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qiaquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA 20 mg/ml</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10,711,454,001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>65001</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

next-generation sequencing of 16s ribosomal rna gene amplicons

微生物生態学の主要な問題の一つは、「そこには誰？」この質問は、さまざまなツールを使用して答えることができますが、長期的な金の規格の一つは、ドメインレベルのPCRによって生成された16SリボソームRNA（rRNAの）遺伝子アンプリコンを配列決定することですゲノムDNAから増幅する反応。伝統的に、これはクローニングおよびサンガー（キャピラリー電気泳動）PCRアンプリコンの配列決定によって行った。次世代シークエンシングの出現は、途方もなく簡略化し、16S rRNA遺伝子配列決定配列決定の深さを増加している。ベンチトップ·シーケンサーの導入は今、小さなラボ数日で、社内で自分の16S rRNAの塩基配列決定を行うことができます。ここでは、ベンチトップ型の次世代シーケンサーを用いた16S rRNA遺伝子アンプリコン配列決定のためのアプローチが詳述されている。環境DNAは、最初の配列決定アダプターとバーコードが含まれているプラ​​イマーを用いてPCRによって増幅される。次いで、それらを、エマルジョンPCRを介して球状粒子に結合されている。粒子がlである使い捨てチップ上oaded及びチップは、シークエンシングが行われた後、配列決定装置に挿入される。配列はFASTQ形式で取得し、ろ過し、バーコードは読み取るのサンプル·メンバーシップを確立するために使用されているされている。濾過し、ビニングされ、その後、さらに公的に利用可能なツールを用いて分析する読み取ります。読み込み例分析はMothurが指定されているソフトウェアパッケージ内の分類探知アルゴリズムで分類された。ここに概説された方法は、簡単な、安価で簡単であり、継続的なゲノム革命から利用するようにより小さなラボを助けるべきである。

シリカゲル上での精製後、PCR増幅の25サイクルで、増幅産物を水50μl中に0.2〜10.0 ngの濃度で通常である。これは出発DNA濃度、サンプルの種類、使用する精製キットによって大きく異なる場合があります。これは、全てのサンプルが同じサイクル数を用いて増幅されるべきであることを念頭に置いて、キメラ形成を回避し、増幅偏りを減少させるために可能な限り最低にPCRサイクルの数を維持することが推奨される。ポリクローナルの数が読み込み最小限に抑え、空の球と読み込みの数を最大にするために、量子ビットの比は0.1と0.3の間であるべきであるとFAM蛍光がイオントレントPGM上の314チップを使用した200を超えるべきである、平均出力は約ある0.3〜0.5 Mは良い品質はMothurの結果のフィルタリングの後に読み込まれます。 表2は、36の多重化は、environを含む実行の手順の各ステップの後に読み込むの数の典型的な内訳を示し精神的サンプルは16SのV3-4領域を標的とするプライマーを用いて増幅し、Mothurを用いて分析した。 Mothurでは、trim.seqs手順は品質フィルターと理由と共に品質のフィルターを通過しなかった配列を含む「* .scrap.fasta」を渡された配列を含む「* .trim.fasta」ファイルを生成するシーケンスヘッダにおける拒絶反応のために。 「オリゴ」ファイルにバーコードが供給されると、このコマンドは、バーコード配列に基づいて、すべての系列のグループメンバーシップを含む「* .groups」ファイルが生成されます。 classify.seqs手順は、Excelで開くことができる「.tax.summary」を生成する。このファイルには、（列のように）サンプルのそれぞれについて、分類学的所属（行数）の要約が含まれています。このファイルは、下流の統計分析のために使用することができ、さまざまな分類学的レベルでのコミュニティの組成物を視覚化する。 「.taxonomy」ファイルは、詳細な分類学的が含まれています各シーケンスのために所属。すべての36の試料にわたる門/クラスレベルで平均コミュニティ組成物は、 図1に示されている。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51709/51709fig1highres.jpg" width="500" /> すべてのサンプル間で門/クラスレベルで1の平均群集組成図。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="248"><colgroup><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:64px;">フォワード</td><td style="width:139px;"> TACGGRAGGCAGCAG </td><td style="width:47px;"></td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;">バーコード</td><td> CTAAGGTAAC </td><td> Sample01 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;">バーコード</td><td> TAAGGAGAAC </td><td> Sample02 </td></tr><tr heighはt = &quot;20&quot;&gt; <td height="20" style="height:20px;">バーコード</td><td> AAGAGGATTC </td><td> Sample03 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;">バーコード</td><td> TACCAAGATC </td><td> Sample04 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;">バーコード</td><td> CAGAAGGAAC </td><td> Sample05 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;">バーコード</td><td> CTGCAAGTTC </td><td> Sample06 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;">バーコード</td><td> TTCGTGATTC </td><td> Sample07 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;">バーコード</td><td> TTCCGATAAC </td><td> Sample08 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;">バーコード</td><td> TGAGCGGAAC </td><td> Sample09 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;">バーコード</td><td> CTGACCGAAC </td><td>サンプル10 </td></tr></tbody></table> Mothurで使用するため、表1の例」オリゴ」ファイル 。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="660"><colgroup><col /><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"></td><td style="width:67px;"> ＃の読み込み</td><td style="width:123px;">前のステップの％ </td><td style="width:107px;">平均。サンプル当たり</td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;">井戸の数</td><td align="center"> 1262519 </td><td> - </td><td align="center"> 35070 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;">ビーズとウェルズ</td><td align="center"> 1114108 </td><td align="center"> 88.20パーセント</td><td align="center"> 30947 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;">テンプレートとビーズ</td><td align="center"> 1112746 </td><td align="center"> 99.90パーセント</td><td align="center"> 30910 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;">モノクローナルビーズ</td><td align="center"> 826805 </td><td align="center"> 74.30パーセント</td><td align="center"> 22967 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;">良質の読み取り（シーケンサからの出力） </td><td align="center"> 782204 </td><td align="center"> 94.60パーセント</td><td align="center"> 21728 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;">峠Mothurフィルター（最小平均50bpのウィンドウ上の20の品質スコア、最小150bpの長さ） </td><td align="center"> 372168 </td><td align="center"> 47.60パーセント</td><td align="center"> 10338 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> GreenGenesにおける門のレベルで分類された（50％信頼閾値） </td><td align="center"> 342171 </td><td align="center"> 91。90％ </td><td align="center"> 9505 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> GreenGenes家族レベルで分類された（50％信頼閾値） </td><td align="center"> 316512 </td><td align="center"> 92.50パーセント</td><td align="center"> 8792 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> GreenGenes属レベル（50％信頼閾値）で分類</td><td align="center"> 289899 </td><td align="center"> 91.60パーセント</td><td align="center"> 8053 </td></tr></tbody></table> 1イオントレント314のチップ上に多重化さ36環境試料のための典型的な実験から生成された読み取りの表2数。

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Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

16SリボソームRNA遺伝子アンプリコンの次世代シーケンシング

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

next-generation-sequencing-of-16s-ribosomal-rna-gene-amplicons

Research

JoVE Journal

Biology

82.8K ビュー.  National Research Council Canada. Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer. 

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Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the subcellular distribution of a specific tagged fluorescent marker in the secretory pathway. Arabidopsis is a powerful biological model for genetic studies because of its genome size, generation time, and conservation of molecular mechanisms among kingdoms. The array genotyping as an approach to map the mutation in alternative to the traditional method based on molecular markers is advantageous because it is relatively faster and may allow the mapping of several mutants in a really short time frame. This method allows the identification of proteins that can influence the integrity of any organelle in plants. Here, as an example, we propose a screen to map genes important for the integrity of the endoplasmic reticulum (ER). Our approach, however, can be easily extended to other plant cell organelles (for example see1,2), and thus represents an important step toward understanding the molecular basis governing other subcellular structures.

A fundamental quest in cell biology is to define the mechanisms that underlie the identity of the organelles that make eukaryotic cells. Here we propose a method to identify the genes responsible for the morphological and functional integrity of plant organelles using fluorescence microscopy and next-generation sequencing tools.

蛍光顕微鏡スクリーニングと次世代シーケンシング：オルガネラの整合性に関与する遺伝子の同定のための有用なツール

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

生物学

Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity and functionality of the gut community will provide insight into the effects of gut microbiota on mosquito life traits. Metagenomic RNA-Seq has become an important tool to analyze transcriptomes from various microbes present in a microbial community. Messenger RNA usually comprises only 1-3% of total RNA, while rRNA constitutes approximately 90%. It is challenging to enrich messenger RNA from a metagenomic microbial RNA sample because most prokaryotic mRNA species lack stable poly(A) tails. This prevents oligo d(T) mediated mRNA isolation. Here, we describe a protocol that employs sample derived rRNA capture probes to remove rRNA from a metagenomic total RNA sample. To begin, both mosquito and microbial small and large subunit rRNA fragments are amplified from a metagenomic community DNA sample. Then, the community specific biotinylated antisense ribosomal RNA probes are synthesized in vitro using T7 RNA polymerase. The biotinylated rRNA probes are hybridized to the total RNA. The hybrids are captured by streptavidin-coated beads and removed from the total RNA. This subtraction-based protocol efficiently removes both mosquito and microbial rRNA from the total RNA sample. The mRNA enriched sample is further processed for RNA amplification and RNA-Seq.

A ribosomal RNA (rRNA) depletion protocol was developed to enrich messenger RNA (mRNA) for RNA-seq of the mosquito gut metatranscriptome. Sample specific rRNA probes, which were used to remove rRNA via subtraction, were created from the mosquito and its gut microbes. Performance of the protocol can result in the removal of approximately 90-99% of rRNA.

モスキートガットメタゲノムRNA-seqのためのリボソームRNAの枯渇

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

次世代シーケンシングによりDNAメチル化解析をターゲット

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

レトロウイルス統合サイトの増幅、次世代シーケンシング、およびゲノムDNAのマッピング

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

細菌群集の特徴付けのための効率的な核酸抽出および16S rRNAの遺伝子配列決定

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

遺伝子発現およびゲノム変化を特徴づけるために、RNAシーケンシングアッセイをターゲットに

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. Deviations from what is considered a healthy microbiota composition (dysbiosis) may impair vital functions leading to pathologic conditions. Recent and ongoing research efforts have been directed toward the characterization of associations between microbial composition and human health and disease.
Advances in high-throughput sequencing technologies enable characterization of the gut microbial composition. These methods include 16S rRNA-amplicon sequencing and shotgun sequencing. 16S rRNA-amplicon sequencing is used to profile taxonomical composition, while shotgun sequencing provides additional information about gene predictions and functional annotation. An advantage in using a targeted sequencing method of the 16S rRNA gene variable region is its substantially lower cost compared to shotgun sequencing. Sequence differences in the 16S rRNA gene are used as a microbial fingerprint to identify and quantify different taxa within an individual sample.
Major international efforts have enlisted standards for 16S rRNA-amplicon sequencing. However, several studies report a common source of variation caused by batch effect. To minimize this effect, uniformed protocols for sample collection, processing, and sequencing must be implemented. This protocol proposes the integration of broadly used protocols starting from fecal sample collection to data analyses. This protocol includes a column-free, direct-PCR approach that enables simultaneous handling and DNA extraction of large numbers of fecal samples, along with PCR amplification of the V4 region. In addition, the protocol describes the analysis pipeline and provides a script using the latest version of QIIME (QIIME 2 version 2017.7.0 and DADA2). This step-by-step protocol is aimed to guide those interested in initiating the use of 16S rRNA-amplicon sequencing in a robust, reproductive, easy to use, detailed way.

This manuscript describes a detailed standardized protocol of high-throughput 16S rRNA-amplicon sequencing. The protocol introduces an integrated, uniformed, feasible, and inexpensive protocol starting from fecal sample collection through data analyses. This protocol enables analysis of large numbers of samples with rigorous standards and several controls.

16S rRNA 増幅配列による糞便の微生物評価ガイドのプロトコル

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective and widely available vaccines are lacking for a majority of these diseases, necessitating the development of novel disease mitigation strategies. To this end, a promising avenue of disease control involves targeting the vector microbiome, the community of microbes inhabiting the vector. The vector microbiome plays a pivotal role in pathogen dynamics, and manipulations of the microbiome have led to reduced vector abundance or pathogen transmission for a handful of vector-borne diseases. However, translating these findings into disease control applications requires a thorough understanding of vector microbial ecology, historically limited by insufficient technology in this field. The advent of next-generation sequencing approaches has enabled rapid, highly parallel sequencing of diverse microbial communities. Targeting the highly-conserved 16S rRNA gene has facilitated characterizations of microbes present within vectors under varying ecological and experimental conditions. This technique involves amplification of the 16S rRNA gene, sample barcoding via PCR, loading samples onto a flow cell for sequencing, and bioinformatics approaches to match sequence data with phylogenetic information. Species or genus-level identification for a high number of replicates can typically be achieved through this approach, thus circumventing challenges of low detection, resolution, and output from traditional culturing, microscopy, or histological staining techniques. Therefore, this method is well-suited for characterizing vector microbes under diverse conditions but cannot currently provide information on microbial function, location within the vector, or response to antibiotic treatment. Overall, 16S next-generation sequencing is a powerful technique for better understanding the identity and role of vector microbes in disease dynamics.

Here we present a next-generation sequencing protocol for 16S rRNA sequencing which enables identification and characterization of microbial communities within vectors. This method involves DNA extraction, amplification and barcoding of samples through PCR, sequencing on a flow-cell, and bioinformatics to match sequence data to phylogenetic information.

次世代の 16S rRNA 増幅シーケンスによる目盛りマイクロバイ評価

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

2段階PCRと次世代16S rRNA遺伝子シーケンシングを用いての微生物叢解析

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high quality and quantity DNA from a well-preserved individual mosquito sufficient for downstream whole genome sequencing. However, reliance on an expensive automated DNA extraction instrument can be prohibitive for many laboratories. Here, the study provides a budget-friendly magnetic-bead-based DNA extraction protocol, which is suitable for low to medium throughput. The protocol described here was successfully tested using individual Aedes aegypti mosquito samples. The reduced costs associated with high quality DNA extraction will increase the application of high throughput sequencing to resource limited labs and studies.

Described here is a DNA extraction protocol using magnetic beads to produce high quality DNA extractions from mosquitoes. These extractions are suitable for a downstream next-generation sequencing approach.

次世代シーケンシングのための磁気ビーズベースの蚊DNA抽出プロトコル

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high ...