이 작품에 의해 지원 되었다 국립 과학 재단 부여 A.S. (뎁 #1427772, 1745411, 1750037).

1. 틱 컬렉션 및 표면 살 균
<ol><li>틱 틱 관련 서식, 진드기 제거에 1 m2 흰 헝겊을 끌어 호스트 종, 또는 실험실15,16틱 양육 수집. 미세 집게를 사용 하 여 진드기를 조작-80 ° c.에서 그들을 저장 하</li>
	<li>개별 PCR 튜브에 틱 하 고 15 vortexing에 의해 표면 오염 물질을 제거 연속적으로 과산화 수소 (H2O2), 70% 에탄올 및 ddH2오 500 μ s</li>
	<li>새로운 PCR 튜브에 진드기를 놓고 건조 하도록 허용 합니다.</li>
	<li>이 튜브에 기계적으로 박격포와 유 봉 (이 연구에 사용), 작은 구슬 구슬 때리는에 사용 하 여 진드기를 분쇄 하 여 틱 조직을 방해 또는 틱 메스와 떨어져 절단.</li>
</ol>2. DNA 정화
<ol><li>상업적으로 이용 가능한 DNA 추출 키트에 제공 된 지침에 따라 개별 틱에서 DNA를 정화. 100 μ의 최종 볼륨을 elute. 참고: 단계 2.2-2.8의 개요 그림 1 을 참조 하십시오. 대체 추출 방법에는 페 놀-클로 프롬 적 출17,18, 에탄올 강수량19또는 추출 chelating 소재20,21포함 됩니다.</li>
	<li>성공 DNA 정화 fluorometer 또는 분 광 광도 계를 사용 하 여 확인 합니다. Fluorometry, 190 μ 이중 가닥 DNA 분석 결과에서 DNA 템플렛의 10 μ를 사용 합니다. 예상된 수익률은 0.1-1.0 ng/μ22. 분 광 광도 학, 핵 산의 정량화에 DNA 템플렛의 1 μ를 사용 합니다. 예상된 A260/280 비율 약 1.823이다.</li>
	<li>증폭, 즉시 진행-20 ° c.에 샘플을 저장 하지 않을 경우</li>
</ol>3. 16S rRNA 유전자 증폭
<ol><li>포함 하는 27.5 μ 반응에서 PCR amplicon 설정: 1 μ M;에서 각 뇌관의 5 μ 상용의 12.5 μ PCR 혼합; 그리고 5 ng/μ 농도에 개별 틱에서 추출한 DNA의 5 μ. 참고 다음 프라이 머를 사용 하 여 16S rRNA 유전자13의 하이퍼 V3-V4 영역의 확대를 위한.: 5 '-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3' 5 '-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3'</li>
	<li>튜브에 대 한 프로그래밍 thermocycler 이동: 95 ° c 3 분;에 대 한 초기 변성 30 대 1) 95 ° C의 25 주기 s, 30 ° C 2) 57 s, 30 대 3) 72 ° C s; 5 분; 72 ° C에서 최종 확장 그리고 10 ° c.에 최종 보류</li>
	<li>PCR 완료 되 면, 4-6 μ/샘플 1.5 %agarose 젤에 로드 하 여 PCR 제품을 시각화. 460에서 밴드를 찾고 증폭을 확인 하는 혈압. 참고: Amplicon PCR 제품 보이지 않을 수 있습니다 젤에 샘플 농도 너무 낮은 경우 (< 10 ng). 뇌관 이합체 존재 낮은 농도 샘플에서 일반적 이다. 다른 비 목표 밴드 경우 어 닐 링 온도 조정 하거나 사이클의 수를 감소 합니다.</li>
	<li>정화, 즉시 진행 4 ° c.에 샘플을 저장 하지 않을 경우</li>
</ol>4. 16 Amplicon 정화
<ol><li>각 샘플에 대 한 새로운 PCR 튜브를 사용 하 여, 케이블의 PCR 제품을 ddH2O 총 60 μ를에 결합. 낮은 DNA 농도와 샘플에 대 한 증폭 바이어스를 줄이고 집중 샘플 수영장을 3 중 amplicon PCR을 수행 합니다.</li>
	<li>실내 온도 소용돌이 그들 사용 하기 전에 잘 상자성 구슬가지고.</li>
	<li>샘플의 60 μ에 상자성 구슬의 48 μ를 추가 하 고 5 분 장소 솔루션은 때까지 5 분에 대 한 자석 선반에 튜브 취소에 대 한 품 어. 제거는 상쾌한. 참고:이 구슬 농도 뇌관 이합체 (< 60 bp)의 제거 대상. 필요한 경우, 다른 일반적인 밴딩을 제거 하 비드 농도 조정 합니다.</li>
	<li>마그네틱 랙 튜브, 추가 갓 80%의 500 μ EtOH. 모든 튜브에 EtOH를 추가한 후 즉시 액체 밖으로 플라스틱. 비즈를 제거 하지 마십시오. EtOH 추가 및 제거 한 번 더 반복 합니다.</li>
	<li>5 분, 또는 작은 균열 구슬에 표시 됩니다 때까지 자석 선반에 튜브를 열어두고 여 초과 EtOH를 제거 하는 예제 건조</li>
	<li>TE 버퍼의 20 μ를 추가 하 고 5-10 분 동안 실내 온도에 자석에서 샘플을 품 어.</li>
	<li>자석에 다시 튜브를 놓습니다. 일단 구슬 및 액체 분리, PCR 제품을 청소를 얻으려면 신선한 튜브는 상쾌한 전송.</li>
	<li>(선택 사항) 4-6 μ/샘플 1.5% 젤에 로드 하 여 성공적인 amplicon 정화를 확인 하려면 제품을 시각화. 460 bp 밴드 표시, 고 아무 뇌관 이합체 이어야 한다.</li>
	<li>샘플을 저장 색인 PCR에 즉시 진행 하지, 4 ° c.</li>
</ol>5. 샘플 바코드 및 정화
<ol><li>앞으로 또는 반전 뇌관, 또는 상업적으로 사용 가능한 라이브러리 인덱스 키트에서 둘 다를 선택 하 여 각 샘플을 독특한 뇌관 조합을 할당 합니다. 참고: 고유 라벨 샘플 시퀀싱 후 차별화 수 있습니다. 키트는 일반적으로 충분 한 뇌관 96-384 샘플 시퀀스를 제공 합니다.</li>
	<li>듀얼 프라이 머, 또는 인덱스, 각 뇌관 (N7xx 및 S5xx), 12.5 μ 상용 PCR 마스터 믹스, ddH2O, 5 μ 그리고 청소 amplicon 제품의 2.5 μ의 2.5 μ를 포함 하는 25 μ 반응에서 PCR을 수행 하 여 샘플을 첨부 합니다.</li>
	<li>튜브에 대 한 프로그래밍 thermocycler 이동: 95 ° c 3 분;에 대 한 초기 변성 8-14 주기 1) 95 ° C 30에 대 한 s, 30 대 2) 55 ° C s 30 3) 72 ° C s; 5 분; 72 ° C에서 최종 확장 그리고 10 ° c.에 최종 보류</li>
	<li>PCR 완료 되 면, 4-6 μ/샘플 1.5 %agarose 젤에 로드 하 여 PCR 제품을 시각화. 550에 밴드를 찾고 증폭을 확인 하는 혈압. 참고: 인덱스 PCR 순환 상태를 시각화 결과 사용 합니다. 일반적인 바인딩 완화 또는 각 샘플에 대 한 보이는 밴드를 사이클 수를 증가 사이클 수를 낮춥니다.</li>
	<li>4 단계에서 나열 된 청소 절차를 반복 합니다. 정리 하는 동안 희석을 방지 하려면 중복에서 인덱스 PCR을 수행 하 고 제품 여기 수영장.</li>
	<li>즉시 라이브러리 정량화 및 정규화를 진행 4 ° c.에 샘플을 저장 하지 않을 경우</li>
</ol>6. 도서관 정량화 및 정규화
<ol><li>단계는 fluorometer 또는 분 광 광도 계를 사용 하 여 5.5에서 각 순화, 바코드 제품의 농도 추정 (단계 2.2 참조). 오후 1 시 약의 농도를 테 버퍼에서 샘플을 희석. 참고: 라이브러리 정량화는 시퀀싱 플랫폼에 권장 하는 농도 로딩 하는 샘플을 달성 하는 데 필요한. 도서관 부 량 정량을 통해 이루어집니다 하지만 시 약 및 시간 저장 정량 이전 샘플 농도 추정 합니다. 이 정량화 키트24에서 제공 하는 정량 기준의 평균 농도 1 오후 농도 라이브러리 정량화의 정확도 극대화 하기 위해 좋습니다.</li>
	<li>(라이브러리 정량화 kit)에서 정량 마스터 믹스, ddH2O, 2.0 μ 및 샘플 또는 표준의 2.0 μ의 6.0 μ를 포함 하는 10 μ 반응에서 정량 Pcr를 수행 합니다. 각 샘플 및 큰 정확도 정밀도 대 한 3 중에서 표준 실행 합니다. 세 개 이상의 희석 수준에서 각 샘플을 실행 (예., 오후 0 시 1 분, 1 오후, 그리고 10 오후 예상된 시작 농도 대 한) 정확한 정량화를 위해. 참고: 제공 된 뇌관 및 표준에 대 한 자세한 내용은 정량화 키트 사용에 따라 달라 집니다 및 제품 기술 데이터 시트에서 사용할 수 있습니다. 이 연구에 사용 된 정량화 키트에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.</li>
	<li>프로그램에 대 한 실시간 PCR 악기를 정량 플레이트 또는 관 이동:; 5 분 동안 95 ° C의 초기 변성 1) 95 ° C의 35 주기 30 s와 45 2) 60 ° C에 대 한 s; 그리고 15 대 1) 95 ° C의 분리 단계 s, 30 대 2) 60 ° C, 및 3) 95 ° C 15에 대 한 s.</li>
	<li>시작 하는 농도 정량 결과에서 얻은 부 량 값과 사용 하는 샘플 희석 수준을 사용 하 여 각 샘플에 대 한 평균을 계산 합니다. 참고: 예를 들어 샘플 희석 1:100,000에 대 한 2pm의 평균 농도 수익률 200의 원래 시작 농도 nM. 부 량 결과; 정확 하지 않을 수 있습니다 주어진된 샘플에 대 한 희석 레벨의 범위 내에 표준 곡선의 경우, 어떤 경우에, 희석 레벨을 조정 하 고 다시 정량 Pcr을 수행.</li>
	<li>4 각 순화, 바코드 샘플 희석 단계 7.5에서에서 계산한 평균 농도에 따라 TE 버퍼에 nM. 참고: 예를 들면, 200의 평균 샘플 농도 nM, 희석 테에 샘플 1시 50분 4 nM 농도 달성 하기 위해 버퍼. 정확한 샘플 농도 시퀀싱 시스템 및 시 약 키트를 사용에 따라 달라 집니다. 권장된 농도 대 한 시퀀싱 시스템 사용자 설명서를 참조 하십시오.</li>
	<li>단일 관으로 모든 개별 라이브러리의 동등한 볼륨 (일반적으로 5-10 μ)을 추가 하 여 결합 된 라이브러리를 만듭니다. 참고: 모든 샘플 4 nM 농도에 있어야 해 서 동일한 볼륨 추가 풀링된 라이브러리에서 모든 샘플의 동등한 농도를 달성 한다.</li>
	<li>6.2-6.4 4 nM 농도 확인 하는 결합 된 라이브러리에 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>결합 된 라이브러리 농도 계산 하 고 희석 또는 다시 4를 달성 하기 위해 필요한 Tris 버퍼를 사용 하 여 최종, 풀링된 라이브러리 구성 nM.</li>
	<li>즉시 샘플 로드를 진행-20 ° c.에 샘플을 저장 하지 않을 경우 손실 또는 변경 내용을 저장 하는 동안 DNA 농도 최소화 하기 위해 정량화 직후 실행 시퀀싱을 수행 합니다.</li>
</ol>7. 도서관 변성 및 희석, 고 시퀀싱 실행 (같은 날에 수행)
<ol><li>NaOH와 단계 6.9에서에서 4 nM 결합된 라이브러리 변성 주: 각 시퀀싱 시스템에 대 한 최종 라이브러리 준비 단계 다. 보다 상세 하 고 업데이트 된 프로토콜에 대 한 시퀀싱 시스템 사용자 가이드를 참조 하십시오. 새로운 사용자가 가능성이 시퀀싱 플랫폼의 사용에 훈련 될 필요가 있을 것 이다 또는 그들의 라이브러리 코어 시퀀싱 시설에 보낼 수 있습니다.</li>
	<li>시퀀싱 시 약 키트 (자료 테이블)에서 제공 하는 버퍼를 사용 하 여 원하는 로드 농도에 변성된 라이브러리를 희석. 참고: 최적의 로드 농도 시퀀싱 시스템 및 일반적으로 1-250 오후25범위에서 다릅니다.</li>
	<li>변성 고 시퀀싱 제어를 희석. 참고: 낮은 다양성 라이브러리에서 발생 하는 시퀀싱 문제에 대 한 수정 시퀀싱 제어를 추가 합니다. NaOH를 사용 하 여 시퀀싱 제어를 변성 하 고 도서관으로 동일한 농도에 희석.</li>
	<li>라이브러리 및 시퀀싱 제어를 결합 한다. 참고: 결합 된 라이브러리를 시퀀싱 제어의 비율 라이브러리 성과 시퀀싱 시스템 사용에 따라 달라 집니다 하지만 일반적으로 1:126.</li>
	<li>결합 된 라이브러리 및 시퀀싱 흐름 셀에 시퀀싱 제어 혼합물을 로드 합니다.</li>
</ol>8. Amplicon 시퀀스 분석
<ol><li>해당 시퀀싱 시스템 사용 하는 클라우드 컴퓨팅 환경에 실행된 통계를 검사 하 여 실행의 전반적인 성공을 평가 합니다. 참고: 연속 읽기 수 등 실행된 통계 시퀀싱 플랫폼 및 시 약 키트 사용에 따라 달라 집니다. 일반적인 시퀀싱 시스템에 대 한 목표 값은 표 1에 나열 됩니다.</li>
	<li>원시 시퀀싱 데이터를 다운로드 하 고 원하는 생물 정보학 오픈 소스 소프트웨어, 양적 통찰력 미생물 생태학 (QIIME)27 또는 Mothur28. 참고: 둘 다 QIIME와 Mothur는 오픈 소스 무료 다운로드. 이러한 프로그램을 사용 하 여 자세한 내용은 온라인 찾을 수 있습니다와 처음 사용자를 위한 상세한 충분히 있습니다. 다음 단계는 QIIME에서 실시 하는 생물 정보학 파이프라인에 대 한 광범위 한 개요를 제공 합니다. Python 친숙 하지만 필요 하지 않습니다 다음 스크립트의 구현을 용이 하 게 한다</li>
	<li>만들고 QIIME에 "validate_mapping_file.py" 스크립트를 사용 하 여 매핑 파일의 유효성을 검사 합니다. 참고: 매핑 파일 샘플 ID, amplicon 뇌관 시퀀스 및 샘플 설명을 포함 한 데이터 분석을 수행 하는 데 필요한 모든 메타 데이터를 포함 합니다. 유효성 검사 단계를 적절 한 형식에 필요한 모든 데이터가 입력 되었습니다 확인 합니다.</li>
	<li>Demultiplex 고 "split_libraries.py" 스크립트 (그림 1)를 사용 하 여 시퀀스를 필터링 합니다. 참고:이 스크립트 샘플 인덱스 뇌관 조합에 따라 바코드 읽기를 할당 하 고 샘플 Id 매핑 파일에서 입력. 그것은 또한 여러 품질 필터링 단계 오류 기반으로 사용자 정의 최소 품질 평가 점수, 시퀀스 길이, 및 최종-트리밍 컷 오프 시퀀싱에 대 한 제어를 수행 합니다.</li>
	<li>"Pick_open_references_otus.py" 스크립트를 사용 하 여 시퀀스에 조작 상 분류학 단위 (OTUs)를 할당 합니다. 참고:이 단계에서 시퀀스 id (일반적으로 97%)의 임계값에 따라 참조 시퀀스 컬렉션에 대 한 클러스터링 됩니다. 참조 시퀀스 컬렉션을 일치 하지 않는 읽기는 서로 대 한 클러스터링 됩니다. 드 노 보 및 폐쇄 기준 OTU 따기 옵션은 또한 사용할 수, 하지만 오픈 참조 따기 QIIME 개발자에 의해 권장 합니다.</li>
	<li>"Alpha_rarefaction.py" 또는 "normalize_table.py" 스크립트를 사용 하 여 OTU 테이블 정규화. 참고:이 단계는 열 합계에는 변형에 대 한 수정 또는 전체 순서 현대 시퀀싱 기술에서 발생 하는 샘플 당 읽습니다. 정규화는 전통적인 진공을 사용 하 여 수행할 수 있습니다 또는 누적 합계 스케일링 등 다른 방법을 통해.</li>
	<li>여러 알파-, 베타-다양성, 다양 성과 분류학 구성 다양성 분석 "core_diversity_analysis.py" 스크립트를 사용 하 여 한 번에 수행 합니다. 참고: 또는, 이러한 분석 실행할 수 있습니다 별도로 개별 스크립트를 사용 하 여 (예를 들어, "alpha_diversity.py").</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

16S rRNA의 다음-세대 시퀀싱와 벡터 microbiomes 병원 체 전송에 미치는 영향의 연구 활성화 미생물 식별을 위한 표준 접근 되고있다. 여기에 설명 된 프로토콜 세부 I. pacificus, 라임 병;에 대 한 벡터 종에에서 미생물 커뮤니티 어셈블리를 조사 하기 위해이 메서드를 사용 하 여 그러나, 그것은 쉽게 다른 틱 종 또는 arthropod 벡터 종 연구에 적용할 수 있습니다.
실제로, 16S rRNA ...

부활과 벡터 품 어진 질병의 확산을 최근 몇 십년 간에서 글로벌 인간과 야생 동물의 건강에 심각한 위협이 포즈. 이 질병의 대부분에 대 한 효과적인 백신 부족 하 고 제어 노력 벡터와 벡터-호스트 상호 작용의 복잡 한 생물 학적 특성에 의해 방해. 병원 체 전송에서 벡터 내 미생물 상호 작용의 역할을 이해 이러한 문제를 회피 하는 새로운 전략의 개발에 대 한 수 있습니다. 특히, 벡터 관련 미생물 공생, symbionts, 병원 균, 미생물로 사이 상호 작용 병원 체 전송에 대 한 중요 한 결과가 있을 수 있습니다. 압도적인 증거를 이제 벡터 미생물과 질병 말라리아, Zika 바이러스, 그리고 라임 질병1,2,3에 대 한 능력 사이의 링크를 보여 주는 예제와 함께이 단언을 지원 합니다. 그러나, 질병 통제 예방 전략으로 이러한 결과 번역 구조, 기능, 및 벡터 microbiomes의 기원에 대 한 훨씬 더 상세한 이해를 요구 한다. 식별 및 다양 한 생태 및 실험 조건에서 벡터 미생물 커뮤니티의이 분야에서 앞으로 중요 한 경로 구성 합니다.
병원 체 벡터의 미생물 주민 확인을 위한 절차는 여기 서양 검은 다리 진드기, Ixodes pacificus, Lyme 질병 병원 체의 보렐 리아 burgdorferi종의 벡터를 이용 하 여 제공 됩니다. 틱 항구 다른 절지동물 보다 인간 병원 체의 더 많은 종류의, 하는 동안 상대적으로 작은 틱 microbiomes4의 생물학과 사회 생태에 대 한 알려져 있다. 그것은 분명 진드기 바이러스, 박테리아, 균 류, protozoans 공생, endosymbionts, 및 과도 미생물 주민5,4의 다양 한 배열을 항구. 이전 작업 Ixodes microbiomes 지리, 종, 성별, 생활 단계, 및 혈액 식사 소스6,,78와 관련 된 강력한 변화를 설명 했다. 그러나,이 변화를 기본 메커니즘 알 수와 자세한 출처의 조사와 이러한 미생물 커뮤니티의 보증 합니다. 틱 수직 전송을 통해 미생물을 수집할 수 있습니다 호스트 및 spiracles, 입, 항문 기 공9를 통해 환경에서 글귀와 접촉. 초기 형성 및 개발 틱 미생물의 형성 요인 이해, 특히 수직 및 환경 전송의 상대적 기여도 자연 패턴 및 눈금의 변화를 이해 하기 위한 중요 한 미생물 다양성 및 이러한 지역 사회 병원 체 전송, 질병 또는 벡터 제어 가능한 응용 프로그램 중 상호 작용 하는 방법.
차세대 시퀀싱 등 강력한 분자 기법, 지금 식별 미생물 지역 사회에 대 한 존재 하 고 다양 한 환경 또는 실험 조건에서 벡터 microbiomes 하 채택 될 수 있다. 이러한 높은 처리량 시퀀싱 접근의 출현 전에 미생물의 식별 현미경 검사 법 그리고 문화에 주로 의존 했다. 현미경 검사 법은 신속 하 고 쉽게 기술, 미생물을 식별 하기 위한 형태학 메서드는 본질적으로 주관적이 고 굵고 낮은 감도와 감지10제한. 문화 기반 방법 미생물 식별을 위해 광범위 하 게 사용 하 고 약물 치료11미생물의 감수 성을 결정 하는 데 사용 수 있습니다. 그러나,이 방법은 또한 겪고 있다 낮은 감도에서 환경 미생물의 2% 미만12설정 실험실에서 경작 될 수 추정 되었습니다. 조직학 얼룩 접근 감지 하 고 벡터 내에서 특정 미생물을 지역화, 틱, 내 다양 한 taxa 배포판의 조사 활성화 미생물 상호 작용에 대 한 가설을 공부 고용 또한 있다. 그러나, 미생물 정체성의 사전 지식을 적절 한 얼룩, 미생물 특성화 및 식별에 어울리지이 이렇게 만들기를 선택 하는 데 필요 합니다. 또한, 조직학 얼룩 매우 시간이 오래 걸리는, 힘 드는 프로세스 이며 큰 샘플 크기 위해 잘 확장 되지 않습니다. 생어 시퀀싱은 마찬가지로 그들의 감도 다양 한 미생물 커뮤니티의 탐지에서 제한 등 전통적인 분자 접근.
다음-세대 시퀀싱 샘플의 많은 수에서 미생물의 급속 한 식별 수 있습니다. 표준 표식 유전자 및 참조 데이터베이스 추가 하면 종종 단계로 속 또는 종의 분류학 해상도 향상. 작은 소 단위 ribosomal RNAs는 자주 16S rRNA 유전자 보존 및 가변 지역의 존재로 인해 가장 일반적인 각 세균에 대 한 독특한 amplicons 보편적인 뇌관의 창조에 대 한 허용으로이 목표를 달성 하는 데 사용 됩니다. 종13,14. 이 보고서는 16S rRNA 차세대 시퀀싱을 통해 틱 미생물에 taxa를 식별 하기 위한 절차를 자세히 설명 합니다. 특히,이 프로토콜 시퀀싱에 대 한 샘플 준비 단계를 강조 합니다. 더는 시퀀싱에 대 한 내용을 일반화 및 생물 정보학 단계 제공 됩니다, 현재 사용할 수 있는 다양 한 시퀀싱 플랫폼 및 분석 프로그램으로 각각의 광범위 한 기존 문서. 이 다음-세대 시퀀싱 방법의 전반적인 타당성은 주요 질병 벡터 내 미생물 커뮤니티 어셈블리의 조사에 적용 하 여 설명 했다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Item</td>
			<td>Name of Material/Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog #</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q3326</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>NanoDrop 8000 Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-8000-GL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK2501</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>AMPure XP beads</td>
			<td>Agen Court</td>
			<td>A63880&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>Magnetic Rack</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MR02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>TE buffer</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T0223</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>Nextera Index Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-121-1011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>KAPA Library Quantification Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>KK4824</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>MiSeq System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>MiSeq Reagent Kit v3&#160;</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MS-102-3001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11</td>
			<td>10 mM Tris-HCl with 0.1% Tween 20</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T7724</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tick microbiome characterization by next-generation 16s rrna amplicon sequencing

최근 수십 년간, 벡터 품 어진 질병이 다시 등장 있고 속도, 상당한 병 적 상태와 사망률 세계를 일으키는 놀라운 확대. 효과적이 고 널리 사용 가능한 백신은 소설 질병 완화 전략의 개발을 필요로 하는이 질병의 대부분 부족 합니다. 이 위해, 질병 통제의 한 유망한 애비뉴 벡터 미생물, 미생물 거주 벡터의 커뮤니티를 대상으로 포함 됩니다. 벡터 미생물 병원 체 역학에서 중추적인 역할을 담당 하 고는 미생물의 조작 벡터 품 어진 질병의 소수에 대 한 감소 된 벡터 풍부 또는 병원 체 전송 이어졌다. 그러나, 질병 제어 응용 프로그램에 이러한 결과 번역 벡터 미생물 생태학, 역사적으로이 분야에서 부족 한 기술에 의해 제한에 대 한 철저 한 이해를 필요 합니다. 차세대 시퀀싱 방법의 출현은 다양 한 미생물 커뮤니티의 급속 한, 높은 병렬 시퀀싱을 활성화 하 고 있다. 높은 보존 16S rRNA 유전자를 대상으로 다양 한 생태 및 실험 조건에서 벡터 내의 미생물의 characterizations 촉진 했다. 이 기술은 PCR, 시퀀싱, 흐름 셀에 로드 샘플 통해 샘플 바코드, 16S rRNA 유전자의 증폭과 생물 정보학 계통 발생 정보 시퀀스 데이터에 맞게 접근. 종 또는 속 수준 id 복제의 높은 숫자에 대 한 일반적으로 따라서 낮은 검출, 확인, 및 전통적인 경작, 현미경, 또는 조직학에 게 얼룩이 지기에서 출력의 문제를 우회 하는이 접근을 통해 달성 될 수 있다 기술입니다. 따라서,이 방법은 다양 한 조건 하에서 벡터 미생물을 특성화 하는 데 적합 하지만 현재 미생물 함수, 벡터, 또는 항생제 치료에 반응 내에서 위치 정보를 제공할 수 없습니다. 전반적으로, 16S 차세대 시퀀싱 정체성과 역할에서 질병 역학 벡터 미생물의 더 나은 이해를 위한 강력한 기술입니다.

총 3 개의 별도 달걀에서 42 틱 클러치 및 두 환경 노출 기간, 0과 토양, 2 주 미생물 시퀀싱에 대 한 처리 했다. 각 치료 그룹, 6-8 틱 샘플 복제를 포함 한 단일 클러치와 노출 시간으로 간주 됩니다. 이러한 처리 진드기 추출 물 다음-세대 시퀀서에 로드 된 하 고 필터를 통과 하는 12,885,713 쌍 간 읽기를 굴복. 이 실행에 포함 211,214 읽기 (이전 수에 포함)의 총 저조한 추출 단계?...

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Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

여기 우리는 식별 및 벡터 내에서 미생물 커뮤니티의 16S rRNA 시퀀싱에 대 한 다음-세대 시퀀싱 프로토콜을 제시. 이 방법은 DNA 추출, 증폭 및 PCR, 시퀀싱 흐름 셀 및 생물 정보학에 계통 발생 정보를 시퀀스 데이터 일치를 통해 샘플의 바코드를 포함 한다.

다음-세대 16S rRNA Amplicon 시퀀싱에 의해 틱 미생물 특성

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

tick-microbiome-characterization-next-generation-16s-rrna-amplicon

Research

JoVE Journal

Biology

12.7K 조회수.  San Francisco State University. 여기 우리는 식별 및 벡터 내에서 미생물 커뮤니티의 16S rRNA 시퀀싱에 대 한 다음-세대 시퀀싱 프로토콜을 제시. 이 방법은 DNA 추출, 증폭 및 PCR, 시퀀싱 흐름 셀 및 생물 정보학에 계통 발생 정보를 시퀀스 데이터 일치를 통해 샘플의 바코드를 포함 한다.

비디오: Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the subcellular distribution of a specific tagged fluorescent marker in the secretory pathway. Arabidopsis is a powerful biological model for genetic studies because of its genome size, generation time, and conservation of molecular mechanisms among kingdoms. The array genotyping as an approach to map the mutation in alternative to the traditional method based on molecular markers is advantageous because it is relatively faster and may allow the mapping of several mutants in a really short time frame. This method allows the identification of proteins that can influence the integrity of any organelle in plants. Here, as an example, we propose a screen to map genes important for the integrity of the endoplasmic reticulum (ER). Our approach, however, can be easily extended to other plant cell organelles (for example see1,2), and thus represents an important step toward understanding the molecular basis governing other subcellular structures.

A fundamental quest in cell biology is to define the mechanisms that underlie the identity of the organelles that make eukaryotic cells. Here we propose a method to identify the genes responsible for the morphological and functional integrity of plant organelles using fluorescence microscopy and next-generation sequencing tools.

형광 - 현미경 검사와 차세대 장면 : Organelle 무결성에 관련된 유전자의 식별을위한 유용한 도구

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

연구

생물학

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

16S 리보솜 RNA 유전자 증폭 산물의 차세대 시퀀싱

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

DNA 메틸화 분석 차세대 시퀀싱 대상

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

레트로 바이러스 통합 사이트의 증폭, 차세대 시퀀싱 및 게놈 DNA 매핑

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

세균 커뮤니티 특성화에 대한 효율적인 핵산 추출 및 16S rRNA의 유전자 시퀀싱

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. Deviations from what is considered a healthy microbiota composition (dysbiosis) may impair vital functions leading to pathologic conditions. Recent and ongoing research efforts have been directed toward the characterization of associations between microbial composition and human health and disease.
Advances in high-throughput sequencing technologies enable characterization of the gut microbial composition. These methods include 16S rRNA-amplicon sequencing and shotgun sequencing. 16S rRNA-amplicon sequencing is used to profile taxonomical composition, while shotgun sequencing provides additional information about gene predictions and functional annotation. An advantage in using a targeted sequencing method of the 16S rRNA gene variable region is its substantially lower cost compared to shotgun sequencing. Sequence differences in the 16S rRNA gene are used as a microbial fingerprint to identify and quantify different taxa within an individual sample.
Major international efforts have enlisted standards for 16S rRNA-amplicon sequencing. However, several studies report a common source of variation caused by batch effect. To minimize this effect, uniformed protocols for sample collection, processing, and sequencing must be implemented. This protocol proposes the integration of broadly used protocols starting from fecal sample collection to data analyses. This protocol includes a column-free, direct-PCR approach that enables simultaneous handling and DNA extraction of large numbers of fecal samples, along with PCR amplification of the V4 region. In addition, the protocol describes the analysis pipeline and provides a script using the latest version of QIIME (QIIME 2 version 2017.7.0 and DADA2). This step-by-step protocol is aimed to guide those interested in initiating the use of 16S rRNA-amplicon sequencing in a robust, reproductive, easy to use, detailed way.

This manuscript describes a detailed standardized protocol of high-throughput 16S rRNA-amplicon sequencing. The protocol introduces an integrated, uniformed, feasible, and inexpensive protocol starting from fecal sample collection through data analyses. This protocol enables analysis of large numbers of samples with rigorous standards and several controls.

16S rRNA Amplicon 시퀀싱에 의해 배설물 미생물 특성화에 대 한 가이드 프로토콜

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to poorly folding proteins or random open reading frames. We have developed a strategy where, by using TEM-1 &#946;-lactamase (the enzyme conferring ampicillin resistance) on a genomic scale, we can select collections of correctly folded protein domains from the coding portion of the DNA of any intronless genome. The protein fragments obtained by this approach, the so called &#34;domainome&#34;, will be well expressed and soluble, making them suitable for structural/functional studies.
By cloning and displaying the &#34;domainome&#34; directly in a phage display system, we have showed that it is possible to select specific protein domains with the desired binding properties (e.g., to other proteins or to antibodies), thus providing essential experimental information for gene annotation or antigen identification.
The identification of the most enriched clones in a selected polyclonal population can be achieved by using novel next-generation sequencing technologies (NGS). For these reasons, we introduce deep sequencing analysis of the library itself and the selection outputs to provide complete information on diversity, abundance and precise mapping of each of the selected fragment. The protocols presented here show the key steps for library construction, characterization, and validation.

The protocols described allow the construction, characterization and selection (against the target of choice) of a &#34;domainome&#34; library made from any DNA source. This is achieved by a research pipeline that combines different technologies: phage display, a folding reporter and next generation sequencing with a web tool for data analysis.

위하여-Seq: Domainome 라이브러리 건설, 유효성 검사 및 페이지 표시 및 다음 세대 시퀀싱 선택 프로토콜

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

2단계 PCR 및 차세대 16S rRNA 유전자 시퀀싱을 사용한 미생물 분석

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

Detection of Tissue-resident Bacteria in Bladder Biopsies by 16S rRNA Fluorescence In Situ Hybridization

Visualization of the interaction of bacteria with host mucosal surfaces and tissues can provide valuable insight into mechanisms of pathogenesis. While visualization of bacterial pathogens in animal models of infection can rely on bacterial strains engineered to express fluorescent proteins such as GFP, visualization of bacteria within the mucosa of biopsies or tissue obtained from human patients requires an unbiased method. Here, we describe an efficient method for the detection of tissue-associated bacteria in human biopsy sections. This method utilizes fluorescent in situ hybridization (FISH) with a fluorescently labeled universal oligonucleotide probe for 16S rRNA to label tissue-associated bacteria within bladder biopsy sections acquired from patients suffering from recurrent urinary tract infection. Through use of a universal 16S rRNA probe, bacteria can be detected without prior knowledge of species, genera, or biochemical characteristics, such as lipopolysaccharide (LPS), that would be required for detection by immunofluorescence experiments. We describe a complete protocol for 16S rRNA FISH from biopsy fixation to imaging by confocal microscopy. This protocol can be adapted for use in almost any type of tissue and represents a powerful tool for the unbiased visualization of clinically-relevant bacterial-host interactions in patient tissue. Furthermore, using species or genera-specific probes, this protocol can be adapted for the detection of specific bacterial pathogens within patient tissue.

This protocol is for the unbiased detection of tissue-associated bacteria in patient biopsies by 16S rRNA in situ hybridization and confocal microscopy.

시투 혼성화에서 16S rRNA 형광에 의한 방광 생검의 조직 상주 박테리아 검출

Visualization of the interaction of bacteria with host mucosal surfaces and tissues can provide valuable insight into mechanisms of pathogenesis. While ...

A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high quality and quantity DNA from a well-preserved individual mosquito sufficient for downstream whole genome sequencing. However, reliance on an expensive automated DNA extraction instrument can be prohibitive for many laboratories. Here, the study provides a budget-friendly magnetic-bead-based DNA extraction protocol, which is suitable for low to medium throughput. The protocol described here was successfully tested using individual Aedes aegypti mosquito samples. The reduced costs associated with high quality DNA extraction will increase the application of high throughput sequencing to resource limited labs and studies.

Described here is a DNA extraction protocol using magnetic beads to produce high quality DNA extractions from mosquitoes. These extractions are suitable for a downstream next-generation sequencing approach.

차세대 시퀀싱을 위한 자기 비드 기반 모기 DNA 추출 프로토콜

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high ...