著者は、次の資金源を認める: 心血管の研究のため魔法、事項の資金。

1. 心筋細胞の調製
<ol><li>17と前述したように、コート 6 ウェル基底膜マトリックスと文化人間誘導された多能性幹細胞 (hiPSCs)。</li>
	<li>上記の方法18を使用してによる CMs に hiPSCs を区別します。</li>
	<li>16-18 d 後の分化には、カルシウムやマグネシウム、孵化 1 ml/トリプシンまたは細胞解離試薬 (のテーブルを参照のも続いてせず、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 1 の 2 mL の各ウェルを洗浄によって心筋細胞を一時中断します。材料) 室温で 5 分間。</li>
	<li>トリプシンまたは細胞解離試薬を中和 (材料表参照) ロズウェル パーク記念研究所 (RPMI) セル培地 B-27 (RPMI/B-27 携帯メディア) の等量を使用して。上下のピペット、付着細胞を緩める。</li>
	<li>10 mL の血清ピペットで中断された心筋細胞を収集し、50 mL の円錐管にそれらを転送します。</li>
	<li>250 x g細胞ペレットを取得するために室温で 5 分間で細胞懸濁液を遠心します。</li>
	<li>RPMI/B-27 携帯メディアの 10 mL にペレットを再懸濁します。</li>
	<li>細胞懸濁液の 20 μ L を組み合わせて 0.4% トリパン ブルー溶液の同量入れ、軽く混ぜます。</li>
	<li>マニュアルの検定を使用してカウントし、細胞懸濁液の濃度と細胞の生存率を入手します。</li>
</ol>2. 線維芽細胞の作製
<ol><li>16を前述のよう人間心臓線維芽細胞 (HCF) (成人心室型) 細胞株の培養を開始します。</li>
	<li>トリプシンまたはセルの解離試薬の適切な量でそれらをインキュベートし、HCFs を中断 (材料表参照) 室温16で 5 分間。T175 フラスコ 10 mL のトリプシンまたはセルの解離試薬の使用しています。</li>
	<li>トリプシンまたは細胞解離試薬を中和 (材料の表を参照してください)、50 mL の円錐管にサンプルを転送し、250 x gを入手する部屋の温度で 5 分間で細胞懸濁液を遠心分離媒体の等量を使用して、ペレット。</li>
	<li>線維芽細胞成長培地 10 mL にペレットを再懸濁します (材料の表を参照してください)。</li>
	<li>HCF 細胞懸濁液の 20 μ L を組み合わせて 0.4% トリパン ブルー溶液の同量入れ、軽く混ぜます。</li>
	<li>自動化された細胞カウンターまたは手動検定を使用してカウントし、新しい細胞懸濁液の濃度と細胞の生存率を入手します。</li>
</ol>3. 血管内皮細胞の調製
<ol><li>ひと臍帯静脈内皮細胞 (株) 線、17を前述の培養を開始します。トリプシンまたはセルの解離試薬の適切な量でそれらをインキュベートし、比較を中断 (材料表参照) 室温17で 3 分間。トリプシンまたは細胞解離試薬を中和する (材料の表を参照してください)、50 mL の円錐管に転送中の等量を使用して、250 x gペレットを取得するために室温で 5 分間で細胞懸濁液を遠心分離します。 注: T175 フラスコ 10 mL のトリプシンまたはセルの解離試薬が使用されました。</li>
	<li>内皮細胞成長培地 10 mL にペレットを再懸濁します (材料の表を参照してください)。</li>
	<li>新生活懸濁液 20 μ L を組み合わせると 0.4% トリパン ブルー溶液の同量とそれを汚す、軽く混ぜます。</li>
	<li>自動化された細胞カウンターまたは手動検定を使用してカウントし、細胞懸濁液の濃度と細胞の生存率を入手します。</li>
</ol>4. ドロップ回転楕円体の作成
<ol><li>絞首刑の場所ドロップ デバイス滅菌 6 ウェル プレートに 850 の細孔 (それぞれ 350 μ m の直径) が含まれています。</li>
	<li>前述のようにセルの 3 種類を分離: による CMs、HCFs、および比較します。1 mL あたり 2,475,000 細胞の濃度で RPMI/B-27 携帯メディアで 70% iPSC CMs、15 %hcfs と 50 mL の円錐管に 15 %huvec の比率で結合します。</li>
	<li>ハンギング 6 ウェル プレートに装着されているドロップ システム (350 μ m の細孔径) と超低添付ファイルの各ウェルに 4 mL (1 mL あたり 2,475,000 細胞) の細胞懸濁液を調剤します。</li>
	<li>回転楕円体が絞首刑に細胞懸濁液を調剤の 12 h の中で形成される自発的にドロップ デバイス。37 ° C、5% CO2、湿度 95%、72 時間 (3 d) の合計のための文化、回転楕円体の成熟のために続けます。</li>
	<li>文化の 72 時間後収穫は絞首刑の下部孔を通って回転楕円体中皿にデバイスを配置し、絞首刑からスフェロイドをリリースに優しくそれを旋回システムをドロップ ドロップ デバイス。</li>
</ol>5. 3-D パッチ作成新規純金型を使用
<ol><li>基本、底正方形板、底網、10 レイヤード サイド滅菌ピンセットのペアの助けを借りて新規金型を作成する網をまとめます。まず、スタック ベースで底正方形板を合わせ、コーナー ポストを使用してネットを底します。スタックし、層の良いステンレス製熊手の網を作成する方向を交互に 10 側網。</li>
	<li>表面張力を軽減し、その後、充填ベースの上に組み立てられた金型を転送 PBS またはメディア ベースの充填をフラッシュします。</li>
	<li>PBS と同じ方法でメディア ネット金型キャビティを濡れています。希望するサイズの前提の空洞に、回転楕円体をゆっくり記入 (2 × 2 × 1 mm、4 × 4 × 1 mm、または 6 × 6 × 1 mm)。 注: ので、細胞凝集塊はタイトな接続で、静的なまま、空洞に回転楕円体の予想量の 120% を供給することを確認します。</li>
	<li>Net トップ、コーナー ポストの上に四角い天板を組み立てる、ストッパーとスフェロイドのにじみを防ぐためにホールディング チューブを固定します。</li>
	<li>いっぱいネット金型システムを 6 ml RPMI/B-27 携帯メディアの全体の組み立てられた金型をカバーする十分な培地で無菌容器に 6 ウェル プレートに転送します。</li>
	<li>3,000-4,000 x gで 7-10 日間スイング シェーカーで塗りつぶされた金型システム 6 ウェル プレートを孵化させなさい。 注: 孵化の持続期間は、心臓のパッチのサイズによって決定されます。大規模なパッチ、インキュベーション時間心臓パッチ成熟増加すべき必要があります。</li>
</ol>6. 新規純金型からのパッチの削除
<ol><li>メディアから金型システムを取り外して滅菌 10 cm 皿に滅菌処理マットの上に置きます。</li>
	<li>ホールディング チューブ、ストッパー、正方形天板上の net を削除します。慎重に滅菌ピンセットのペアを持つ層状側網 1 つずつをスライドさせます。抜後、そのまま心臓パッチは、ネットの底の上に取得されます。</li>
	<li>滅菌鉗子を使用してパッチでネットの下をピックアップし、RPMI/B27 メディアの 5 ml 35 mm ディッシュにネットの下を転送します。軽く料理、または無菌細胞スクレーパーとネットをゆっくりと旋回してネットの下からパッチを緩めます。ネットの下から剥離後 RPMI/B27 メディアで心筋組織を培養することができます。</li>
	<li>35 mm ディッシュの浮遊 3次元心筋パッチをインキュベートし続けます。機能同期鼓動は、鋳型から取り出した後、早ければ 24 時間観察できます。</li>
	<li>Net の金型からパッチを削除した後整合性と時間同期暴行増加の強度とその形状が維持されることを確認します。 注: 3-D ネット金型ベース心筋パッチ抜後コンポーネント cardiospheres の電気的統合を出展しました。60 から 80 ビート/分 60 日間以上の永続化に至るまで、周波数を見ました。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Tissue+Engineering+With+Cells+Derived+From+Human-Induced+Pluripotent+Stem+Cells+and+a+Native-Like,+High-Resolution,+3-Dimensionally+Printed+Scaffold.">Myocardial Tissue Engineering With Cells Derived From Human-Induced Pluripotent Stem Cells and a Native-Like, High-Resolution, 3-Dimensionally Printed Scaffold.</a> Circulation Research. 120 (8), 1318-1325 (2017).</li><li>Borovjagin, A. V., Ogle, B. M., Berry, J. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redirecting+cardiac+growth+mechanisms+for+therapeutic+regeneration.">Redirecting cardiac growth mechanisms for therapeutic regeneration.</a> Journal of Clinical Investigation. 127 (2), 427-436 (2017).</li><li>Bartholoma, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+reaggregates+of+embryonic+cardiomyocytes:+a+potential+model+system+for+monitoring+effects+of+bioactive+agents.">Three-dimensional in vitro reaggregates of embryonic cardiomyocytes: a potential model system for monitoring effects of bioactive agents.</a> Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 814-822 (2005).</li></ol>

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この法の意義は、その再現性と結果の多層の心臓組織の有効性であります。心臓組織工学分野での現在の目標の一つ、打撃、多層、および機能の 3次元心筋パッチを作成する方法を特定します。心筋細胞、血管内皮細胞、線維芽細胞から成る小説ネット型に回転楕円体の手動直播による多層心臓組織を作成する効率的かつ再現性のある方法を報告する.このメソッドで使用される純金型は、様々 な異なるサイズ 6 × 6 × 1 mm 2 × 2 × 1 mm に至る組織を作成するために。については技術を別金型形状と目的組織のジオメトリに応じて、システムの変更もできます。記載されている濃度と比は以前、による CMs に最適化した、異なる細胞型への変更追加の評価が必要になります。
治療および診断モデルの開発の希望を持つ bioprinter 技術を用いた 3次元心臓組織の体外作成を検討されています。ただし、現在バイオプリンティング法は面倒で、膨大な時間と針や足場材料などの補助的なサポート構造の使用を必要です。これらの補助的な存在は、栄養素や酸素18の拡散構造減少をサポートします。したがって、中心壊死は19酸素と栄養を供給する毛細血管の不足のため、現在の 3次元心臓構造の主要な関心事であります。坂口らは挟む指向の手法を適用した細胞シートと血管床バイオリアクターを使用して内皮細胞ネットワーク20を開発します。ここで紹介するネット型システム、金型キャビティは栄養素や酸素、サポート構造や足場の必要なしの十分な拡散を許可できます。さらに、金型ベース方式は効率、両方、シードには回転楕円体の金型やその後の修正プログラムのメンテナンスに特殊なスキルは必要ありません。そのため、同期的に暴行を取得迅速かつ安価な方法と心臓機能のパッチです。
回転楕円体の直径と回転楕円体のそれぞれで使用される数を最適化するトラブルシューティングや細胞の種類と量に関する変更を実施したドロップ デバイスをハングしています。このネットの金型ベースのメソッドの回転楕円体径と回転楕円体の使用数は適切なサイズの機能的な心筋組織を作成する非常に重要だった。心臓組織を作成するため最適な回転楕円体のサイズを最適化するために別の細胞濃度を試みた。セルの 3 種類は、絞首刑によって心臓の回転楕円体の作成に使われた 70% iPSC CMs、15 %hcfs と 15 %huvec 含まれてドロップ デバイス。光学顕微鏡各孔で自発的に形成された回転楕円体は、72 時間後を叩いている簡単に観察されました。絞首刑の濃度が細胞スフェロイドの直径が増加したことがわかったドロップ デバイス。濃度の異なる回転楕円体、各デバイスで 300 回転楕円体に 100 回転楕円体から RPMI/B27 培地 4 ml を試みた。数多くの試験で、結果として回転楕円体の最適な直径が得られた mL あたり 2,475,000 細胞の濃度を分かった。回転楕円体の最適化された直径、楽なコレクションおよび多層の心臓組織作成 net 金型ベース メソッドする重要なステップであった積み上げ純金型の回転楕円体のシードを経験しました。
プロトコルの最も重要なステップは、回転楕円体サイズの最適化です。このメソッドで使用されている回転楕円体が他バイオプリンティング テクニック21で使用されている回転楕円体ボディのサイズよりも小さいことを言及する価値があります。大きい回転楕円体は、栄養と酸素の22の十分な拡散のための中心壊死が発見されています。小さい直径の回転楕円体と各回転楕円体の中心に栄養と酸素の十分な拡散がより容易に行え、結果パッチのすべての領域で細胞の生存率を増加します。ここで提示されたプロトコル、これネットを用いた心筋の正常に作成に貢献 350 μ m の回転楕円体の直径は、改良されたセル実行可能性とより接触面積、回転楕円体間と信じてします。したがって、これは記述の方法論の重要なステップです。他のセルタイプをプロトコルに合わせて、追加の回転楕円体サイズ最適化実験が必要です。
このアプローチの限界、スフェロイドの積み重ねを正確に制御することができないことがあります。結果組織パッチと異種の厚さの不均一性の領域でこの結果します。また、スフェロイドの播種の実際の実践的な時間は最小限、大規模な多層パッチの作成、回転楕円体の融合のために許可するように拡張された文化時間が必要です。
将来のアプリケーションのこの小説の純金型ベースのメソッドは最小限の労力で 3次元、無料の足場の心臓組織を作成する効率的かつ再現性のある方法。結果として得られる多層組織は満足のいく構造的整合性と同期打撃動作溶かされた回転楕円体から成っています。この金型ベース方式設計組織の方法、コスト効率と拡張性の高い現在代替バイオ加工を紹介を目標に心不全の治療のため臨床応用可能な心臓組織を作成する可能性があります。虚血性または機能不全心筋23を交換します。さらに、このメソッドを活用して、潜在的な新規薬物療法24の患者固有の上映のため心臓の組織を作成することできます。

現在の心臓組織工学の目的は、交換または構造と負傷した心筋組織1の機能を修復する治療法を開発することです。ネイティブの心臓組織の重要な収縮と電気生理学的特性を示す心筋組織の 3次元モデルを作成する方法には2,3を急速に拡大しています。様々 な戦略を模索、研究4,5で使用されます。これらの方法はゼラチン、コラーゲン、フィブリン、ペプチド6などの合成と天然特定の生理活性物質ゲルの使用からバイオ インク蒸着の技術2バイオプリンティング技術の7まであります。
足場自由な方法が外部足場材料8を組み込むことの欠点がなく、生体材料ベースのメソッドとして匹敵する組織を作り出すことができることが示されています。オレン カスピーらは、種々 の細胞の結合が高度に血管人間設計された心臓ティッシュ9の生成を有効を示した。あごらは、回転楕円体から心臓のパッチを作成するための 3次元印刷法を開発しました。結果として得られるパッチ参照比10で血管内皮細胞、線維芽細胞、心筋細胞で構成されます。回転楕円体は、効果的な「ビルディング ブロック」足場無料心臓組織の作成の彼らの低酸素状態に対する耐性があるし、注入11,12の十分な機械的完全性を持って示されています。以前の研究は、回転楕円体を作成するためのいくつかの製造方法を示している、絞首刑の使用を含むドロップ メソッド、スピナー フラスコ13、マイクロ流体システム14、および非付着性文化の表面光沢をめっきしたものアガロース マイクロ金型15。このプロトコルでは絞首刑を使用してドロップ デバイスは、一度に何百もの回転楕円体を凝縮の細孔が含まれています。
本研究は、小説と正方形の金型に、回転楕円体を手動でシードとシェーカーで組織の成熟をインキュベートを含む心臓組織の創造のための効率的な足場無料メソッドを示します。いつも静置培養条件下で酸素の拡散は中心壊死をもたらす組織構成要素の外側の側面に限定されます。ただし、ネット型で金型にシードすべての楕円は、栄養素や酸素の増加の拡散を可能にする一定の流体運動とメディアに没頭しています。また、この金型ベースのメソッドは、最小限の労力でサイズの異なる組織パッチの同時作成、金型から得られた組織を簡単に削除できます。この手法スキャフォールド フリー、多層の心筋パッチの効率的かつ再現可能な作成できます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:708px;" width="708">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Human Cardiac fibroblasts (HCF)</td>
			<td style="width:139px;">Sciencell</td>
			<td style="width:119px;">6310</td>
			<td style="width:220px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">FM-2 Consists of Basal Medium</td>
			<td style="width:139px;">Sciencell</td>
			<td style="width:119px;">2331</td>
			<td style="width:220px;">HCF culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)</td>
			<td style="width:139px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-2935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">EGM+Bullet Kit&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC5035</td>
			<td>HUVEC culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">E8 media&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A1517001</td>
			<td>HiPSC culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Geltrex&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">TrypLE Express Enzyme (1X)</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12604013</td>
			<td>Trypsin and Cell dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:231px;">RPMI media</td>
			<td style="width:139px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11875093</td>
			<td style="width:220px;">RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:231px;">B-27 supplement (50x)</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">17504044</td>
			<td style="width:220px;">RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Novel net mold&#160;</td>
			<td style="width:139px;">TissueByNet Co.,Ltd</td>
			<td style="width:119px;">NM25-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Hanging drop plate</td>
			<td style="width:139px;">Kuraray Co.,Ltd</td>
			<td style="width:119px;">MPc350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">6 well plates&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">CLS-3516</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a net mold-based method of scaffold-free three-dimensional cardiac tissue creation

このプロトコルでは、小説と追加足場材料なし三次元 (3 D) の心筋組織を作成する簡単な純金型ベース方法をについて説明します。人間誘導された多能性幹細胞由来心筋細胞 (iPSC CMs)、心臓 (HCFs)、線維芽細胞およびひと臍帯静脈血管内皮細胞 (Huvec) は、隔離され、70 %ipsc - cms、15 %hcfs と 15 %huvec 細胞懸濁液を生成するために使用します。回転楕円体の数百人を一度に凝縮用孔を含む超低添付ファイル「ハンギング ドロップ」システムの共培養しています。セルを集計、自発的に共培養 3 日後暴行スフェロイドを形成します。スフェロイドは収穫され、新規金型に播種、シェーカーのインキュベーター内で培養しました。スフェロイドは播種後約 7 日成熟した機能的な組織になります。結果多層組織は満足のいく構造的整合性と同期打撃動作溶かされた回転楕円体から成っています。この新しいメソッドでは、将来的に心不全の治療のために設計された組織を作成する再現性とコスト効果の高い方法として有望な可能性があります。

実験では、我々 は 70% iPSC CMs、15% HCFs mL あたり 2,475,000 細胞の濃度で RPMI/B-27 携帯メディアで 15 %huvec の細胞懸濁液を利用しました。プロトコルの手順 4.3 細胞懸濁液を作成した後は、ハンギング ドロップ システム、超低添付ファイルの各ウェルに細胞懸濁液 4 mL を分配しました。絞首刑の使用ドロップ システムは湿度 95%、5% CO2、37 ° C で培養 3 日後回転楕円体を破っての何百もの自発の形成で起因しました。スフェロイドは 4 X、10 X 倍率平均直径 350 μ m の文化 (図 1) の 72 時間後に顕微鏡下で叩いている簡単に観察されました。
、回転楕円体を収穫後、プロトコルの手順 6.5 の終わりに金型は簡単に単純なピペッティング メソッドをシードだった。回転楕円体の融合で使用できるカビの養殖金型の後廃止機械的完全性とそのまま心臓パッチでしました。カビや文化の 24 h から取り出した後、回転楕円体 (図 2左) の機械的統合を確認する心臓組織の機能と同期の鼓動は観察されました。また観測された回転楕円体の複数の層が光顕 (図 2右) に整合的で自発的に打っていた。
モールド ベース 3次元心筋パッチを心筋マーカーのトロポニン t. 共焦点イメージングも行ったネットの免疫組織化学的解析が示唆された配向心筋トロポニン T 式 (図 3) が一堂に出展します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58252/58252fig1.jpg"> 図 1: ハンギング ドロップ スフェロイド作成します。人間誘導された多能性幹細胞由来心筋細胞 (による CMs)、心臓 (HCFs)、線維芽細胞およびひと臍帯静脈血管内皮細胞 (Huvec) が分離・で 70% iPSC CMs、15% HCFs 15 %huvec と細胞懸濁液を生成するために使用、1 mL あたり 2,475,000 細胞の濃度。72 時間後各孔で自発的に形成された回転楕円体は、光学顕微鏡を叩いている簡単に観察されました。左側で、[スケール バー = 1,000 μ m;右側のパネルでスケール バー = 400 μ m.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58252/58252fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58252/58252fig2.jpg"> 図 2: コンポーネントの回転楕円体の統合を表示する多層心臓組織を作成します。純モールドから剥離後 3次元心筋パッチその形を維持して、左側のパネルに示すように、回転楕円体の機械的統合を示す同期の鼓動を実証 (、スケールバー = 1,000 μ m)。右側のパネルに示すように、回転楕円体の積層多層膜は光学顕微鏡で検査された (、スケール バー = 400 μ m)、自発的に叩いているを観察しました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58252/58252fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58252/58252fig3.jpg"> 図 3: 心臓の組織の蛍光評価します。蛍光分析に配向心筋トロポニン T 式を構成する純金型ベースの 3次元心筋組織が見つかりました。スケールバー = 50 μ m.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58252/58252fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

スキャフォールド フリー三次元心筋組織構築純金型ベース方式

このプロトコルでは、満足のいく構造的整合性と同期打撃動作立体足場無料心臓組織を作成する純金型ベースの方法について説明します。

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...

a-net-mold-based-method-scaffold-free-three-dimensional-cardiac

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.8K ビュー.  The First Hospital of Jilin University. このプロトコルでは、満足のいく構造的整合性と同期打撃動作立体足場無料心臓組織を作成する純金型ベースの方法について説明します。

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Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

三次元光学分解能光音響顕微鏡

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

生物工学

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical devices1-3. In this paper, we focus on one- (1D), two- (2D), and three-dimensional (3D) printing of conductive metallic inks in the form of flexible, stretchable, and spanning microelectrodes.
Direct-write assembly4,5 is a 1-to-3D printing technique that enables the fabrication of features ranging from simple lines to complex structures by the deposition of concentrated inks through fine nozzles (~0.1 - 250 &mu;m). This printing method consists of a computer-controlled 3-axis translation stage, an ink reservoir and nozzle, and 10x telescopic lens for visualization. Unlike inkjet printing, a droplet-based process, direct-write assembly involves the extrusion of ink filaments either in- or out-of-plane. The printed filaments typically conform to the nozzle size. Hence, microscale features (&lt; 1 &mu;m) can be patterned and assembled into larger arrays and multidimensional architectures.
In this paper, we first synthesize a highly concentrated silver nanoparticle ink for planar and 3D printing via direct-write assembly. Next, a standard protocol for printing microelectrodes in multidimensional motifs is demonstrated. Finally, applications of printed microelectrodes for electrically small antennas, solar cells, and light-emitting diodes are highlighted.

Planar and three-dimensional printing of conductive metallic inks is described. Our approach provides new avenues for fabricating printed electronic, optoelectronic, and biomedical devices in unusual layouts at the microscale.

導電性インクの平面および三次元印刷

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

三次元インクジェット印刷技術を用いて、ヒト軟骨組織の作製

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

三次元コラーゲンマトリックス内の細胞移動の解析

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

三次元の全層皮膚等価物と自動傷つけ処理の発生

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing drugs targeted at the liver, requires a platform in which cells receive proper biochemical and mechanical cues. Recent liver tissue engineering systems have employed three-dimensional (3D) scaffolds composed of synthetic or natural hydrogels, given their high water retention and their ability to provide the mechanical stimuli needed by the cells. There has been growing interest in the inverted colloidal crystal (ICC) scaffold, a recent development, which allows high spatial organization, homotypic and heterotypic cell interaction, as well as cell-extracellular matrix (ECM) interaction. Herein, we describe a protocol to fabricate the ICC scaffold using poly (ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) and the particle leaching method. Briefly, a lattice is made from microsphere particles, after which a pre-polymer solution is added, properly polymerized, and the particles are then removed, or leached, using an organic solvent (e.g., tetrahydrofuran). The dissolution of the lattice results in a highly porous scaffold with controlled pore sizes and interconnectivities that allow media to reach cells more easily. This unique structure allows high surface area for the cells to adhere to as well as easy communication between pores, and the ability to coat the PEGDA ICC scaffold with proteins also shows a marked effect on cell performance. We analyze the morphology of the scaffold as well as the hepatocarcinoma cell (Huh-7.5) behavior in terms of viability and function to explore the effect of ICC structure and ECM coatings. Overall, this paper provides a detailed protocol of an emerging scaffold that has wide applications in tissue engineering, especially liver tissue engineering.

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Polyethylene glycol Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

This manuscript presents a detailed protocol for the fabrication of an emerging three-dimensional hepatocyte culture platform, the inverted colloidal crystal scaffold, and the concomitant techniques to assess hepatocyte behavior. The size-controllable pores, interconnectivity and ability to conjugate extracellular matrix proteins to the poly(ethylene glycol) (PEG) scaffold enhance Huh-7.5 cell performance.

肝組織工学のための三次元細胞培養プラットフォーム：逆コロイド結晶ポリ（エチレングリコール）足場の作製

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts are first isolated, counted and mixed at desired cell ratios. They are co-cultured in individual wells in ultra-low attachment 96-well plates. Within 3 days, beating spheroids form. These spheroids are then picked up by a nozzle using vacuum suction and assembled on a needle array using a 3D bioprinter. The spheroids are then allowed to fuse on the needle array. Three days after 3D bioprinting, the spheroids are removed as an intact patch, which is already spontaneously beating. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

3D Bioprintingを用いたスフェロイドの機械的統合を示す心臓組織の創出

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to replace lost neurons and regenerate axonal pathways. However, during nervous system development, neuronal migration and axonal extension often occur along pathways formed by other cells, referred to as &#34;living scaffolds&#34;. Seeking to emulate these mechanisms and to design a strategy that circumvents the inhibitory environment of the CNS, this manuscript presents a protocol to fabricate tissue engineered astrocyte-based &#34;living scaffolds&#34;. To create these constructs, we employed a novel biomaterial encasement scheme to induce astrocytes to self-assemble into dense three-dimensional bundles of bipolar longitudinally-aligned somata and processes. First, hollow hydrogel micro-columns were assembled, and the inner lumen was coated with collagen extracellular-matrix. Dissociated cerebral cortical astrocytes were then delivered into the lumen of the cylindrical micro-column and, at a critical inner diameter of &#60;350 &#181;m, spontaneously self-aligned and contracted to produce long fiber-like cables consisting of dense bundles of astrocyte processes and collagen fibrils measuring &#60;150 &#181;m in diameter yet extending several cm in length. These engineered living scaffolds exhibited &#62;97% cell viability and were virtually exclusively comprised of astrocytes expressing a combination of the intermediate filament proteins glial-fibrillary acidic protein (GFAP), vimentin, and nestin. These aligned astrocyte networks were found to provide a permissive substrate for neuronal attachment and aligned neurite extension. Moreover, these constructs maintain integrity and alignment when extracted from the hydrogel encasement, making them suitable for CNS implantation. These preformed constructs structurally emulate key cytoarchitectural elements of naturally occurring glial-based &#34;living scaffolds&#34; in vivo. As such, these engineered living scaffolds may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms in vitro or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding following CNS degeneration in vivo.

We showcase the development of self-assembled, three-dimensional bundles of longitudinally aligned astrocytic somata and processes within a novel biomaterial encasement. These engineered &#34;living scaffolds&#34;, exhibiting micron-scale diameter yet extending centimeters in length, may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding.

三次元組織配置に発達メカニズムを要約し、神経系の再生を容易にするアストロ サイト ネットワーク

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an environment that closely mimics the structural features of non-polarized tissue. Furthermore, the particular intrinsic nanofiber structure of the scaffold makes it transparent to visual light, which allows for easy visualization of the sample under microscopy. This advantage was largely used to study cell migration, organization, proliferation, and differentiation and thus any development of their particular cellular function by staining with specific dyes or probes. Furthermore, in this work, we describe the good performance of this system to easily study the redifferentiation of expanded human articular chondrocytes into cartilaginous tissue. Cells were encapsulated into self-assembling peptide scaffolds and cultured under specific conditions to promote chondrogenesis. Three-dimensional cultures showed good viability during the 4 weeks of the experiment. As expected, samples cultured with chondrogenic inducers (compared to non-induced controls) stained strongly positive for toluidine blue (which stains glycosaminoglycans (GAGs) that are highly present in cartilage extracellular matrix) and expressed specific molecular markers, including collagen type I, II and X, according to Western Blot analysis. This protocol is easy to perform and can be used at research laboratories, industries and for educational purposes in laboratory courses.

Here, we present a protocol to obtain 3D-culture systems in self-assembling peptide scaffolds to promote the differentiation of dedifferentiated human articular chondrocytes into cartilage-like tissue.

三次元ペプチド足場で哺乳動物の細胞を培養

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

Microdissection of Primary Renal Tissue Segments and Incorporation with Novel Scaffold-free Construct Technology

Kidney transplantation is now a mainstream therapy for end-stage renal disease. However, with approximately 96,000 people on the waiting list and only one-fourth of these patients achieving transplantation, there is a dire need for alternatives for those with failing organs. In order to decrease the harmful consequences of dialysis along with the overall healthcare costs it incurs, active investigation is ongoing in search of alternative solutions to organ transplantation. Implantable tissue-engineered renal cellular constructs are one such feasible approach to replacing lost renal functionality. Here, described for the first time, is the microdissection of murine kidneys for isolation of living corticomedullary renal segments. These segments are capable of rapid incorporation within scaffold-free endothelial-fibroblast constructs which may enable rapid connection with host vasculature once implanted. Adult mouse kidneys were procured from living donors, followed by stereoscope microdissection to obtain renal segments 200 - 300 &#181;m in diameter. Multiple renal constructs were fabricated using primary renal segments harvested from only one kidney. This method demonstrates a procedure which could salvage functional renal tissue from organs that would otherwise be discarded.

Tissue-engineered renal constructs provide a solution for the organ shortage and deleterious effects of dialysis. Here, we describe a protocol to micro dissect murine kidneys for isolation of cortico-medullary segments. These segments are implanted into scaffold-free cellular constructs, forming renal organoids.

腎組織のプライマリ セグメントと新規スキャフォールド フリー構造技術と定款の

Kidney transplantation is now a mainstream therapy for end-stage renal disease. However, with approximately 96,000 people on the waiting list and only ...

スキャフォールド フリー三次元心筋組織構築純金型ベース方式

スキャフォールドフリー三次元心筋組織構築純金型ベース方式