この方法は、C.elegansの細胞周期および生殖細胞集団の動態に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、トランス遺伝子を必要とせず、免疫蛍光染色と互換性があり、多くの異なる条件下で細胞を研究するように改変できることです。私は最初にこの方法がSchedaラボで使用されているのを見たとき、私は非常に興奮していました。
この方法は、C.elegans細胞周期に関する洞察を提供することができますが、老化、栄養、または遺伝子型の変化に関するより広範な質問にも適用できます。一般的に、この方法に新しいラボは、最初の特異性またはC.elegansヘマトキシリン染色に苦労する可能性があります。M9バッファーの100ミリリットルに10ミリモルEdUの200マイクロリットルを追加する無菌技術を使用して始め、そして新鮮な一晩MG 1693大腸菌培養の4ミリリットルに適切なサプリメント。
特異な作りは、EdU とチミジンの補充の微妙なバランスを必要とします。.チミジンの量は大腸菌が十分に成長するのに十分でなければならないのに対し、EdUの量はレベリングに対する堅牢なシールドに十分でなければならない。摂氏37度と200RPMで24時間を超えなくなった後、無菌技術を使用して、遠心分離のために2〜4個の無菌50ミリリットル円錐管の間で培養を分割します。
新鮮なM9バッファーのペルチン4ミリリットルを再懸濁し、同じピペットを使用して、個々の室温60ミリリットルM9 Aガードシャーレの中心にEdUラベル付けEColi MG1693溶液の約8滴を適用します。線虫にEdU標識細菌を供給するには、新鮮なPBSを使用して、線虫増殖培地皿からC.Elegansを1.5ミリリットルのチューブに洗浄し、動物が重力によって短時間沈着できるようにします。PBSの1ミリリットルで動物を1〜2回洗い、ガラスパスツールピペットを使用して、PBSの小さな一滴でEdU芝生の中央に線虫を転送します。
液体が吸収されるまで数分待ち、実験プロトコルに従って摂氏20度で少なくとも30分間培養を行います。インキュベーションの最後に、2ミリリットルのPBSを使用して、EdU培養プレートからガラス解剖皿にワームを洗い流します。先に説明したように線虫性腺の解剖と固定化の後、0.1%トゥイーン20を補ったPBSで小さな1ミリリットルのホウケイ酸ガラス管と長いガラスパスツールピペットをすすいで、ピペットを使用して少量のPBSツイーーンで固定ゴナドをチューブに移します。
遠心分離によって生殖腺を収集し、ゴナドペレットを乱すことなく、できるだけ多くのスーパーナテントを除去するために、長く、引き出されたガラスの牧草地ピペットを使用しています。EdU検出のために、100マイクロリットルのクリックEdUカクテルを生殖腺に加え、室温で30〜60分間インキュベーションするために実験室フィルムでチューブを覆います。インキュベーションの最後に、反応リンスバッファーの100マイクロリットルで1回、PBSトゥイーンの1ミリリットルで4回生殖腺を洗浄します。
最後の洗浄後、DAPIを添加した25マイクロリットルのアンチフェード実装媒体をサンプルに加えます。培地が生殖腺の上に落ち着いている間、大きな2.5%のアガロースパッドを標準的なガラス顕微鏡スライドの上に置きます。その後、2番目のスライドで平らにします。
次に、長いガラス製のパスツールピペットを使用し、ピペットの狭い先端に液体と生殖腺のすべてを保持して、パッドに生殖腺を移す際のサンプル損失を最小限に抑えます。爪楊枝に接着したまつげを使用して、アガロースパッドの上に生殖腺を配布し、ほこり粒子を取り除きます。その後、ゆっくりと長方形のガラスカバースリップを生殖腺に下げ、気泡を避けるように注意し、ラボ組織で余分な溶液を取り除きます。
3次元のセルを確実に数えるには、いくつかの練習が必要です。フィジーのセルカウンタープラグインとスクリプトのようなスクリプトを使用して、セルに重複を削除するマークを付けると、カウントを再現しやすくなっています。カバースリップが一晩落ち着くようにした後、セルカウンタープラグインとフィジーを使用して各核を手動でカウントし、ホスホヒストン3 EdUまたはプレジェネターゾーンセル標識の有無に応じて個々の核にラベルを付けます。
EdU 信号は DAPI 信号と共にローカライズします。いくつかの核では、EdU信号はすべての染色体をカバーし、他の核では、EdU信号はS相後期に複製されるX染色体上の可能性が高い1〜2つの明るいパンクタに局地する。正常な30分標識からのEdU信号は、プレジェネタゾーン内の核の約半分に局地化する。
この技術は野生型の若年成動物では一貫して機能しますが、交尾した5日間の雌雄同体のかなりの部分は、30分間のEdUパルスでラベル付けに失敗します。G2の持続時間は、時間経過でEdU陽性であるM相の核の割合を分析することによって推定することができ、G2の中央値および最大持続時間の計算を可能にする。G2およびG1の持続期間は、EdU陽性であるプレジェネターゾーン核の全ての割合から推定することができ、組み合わされたフェーズの最大持続時間の計算を可能にする。この手順を試みる際には、実験間の変動を最小限に抑えるために、同じ EdU 皿のバッチを使用することを忘れないでください。
この手順に従って、追加の抗体による染色のような他の方法を、細胞周期、細胞運命、またはシグナル伝達経路に関する追加の質問に答えることができます。核酸アナログやパラフェルメルダハイドの操作は危険であり、ニトロール手袋を着用するなど、常にこの手順を実行する間に予防措置を講じるべきであることを忘れないでください。
