増殖は細胞機能の重要な尺度である。このプロトコルは、研究者が市販のキットの高コストなしでラボで敏感な拡散アッセイを開発することを可能にします。この技術の主な利点は、細胞の過酷な治療および/または放射能の使用を避けることです。
このテクニックを実証することは、私の研究室のマネージャーであるヴィッキー・ウォンです。増殖をアッセイするには、平滑筋細胞培地を用いたフラスコから96ウェルプレートで2%胎児ウシ血清、プレートを20,000個のDMEMで1ミリリットル当たり20,000個の細胞で除去する。一晩摂氏37度で細胞を成長させます。
増殖を刺激する正のコントロールとして3〜6ウェルにミリリットル血小板由来の成長因子あたり30ナノグラムを加える。次に、PBSをネガティブコントロールと同じ数のウェルに追加します。72時間インキュベートします。
希釈は、以前に5ミリモルEdUストックを1ミリモルに調製し、72時間培養期間の最後の24時間、各ウェルに2マイクロリットルを加えた。バックグラウンド蛍光と発光を決定するために、EdUなしで複製の1セットを保持します。24時間後、培地を取り除いて細胞を固定し、4%パラホルムアルデヒドのウェルあたり150マイクロリットルを加え、室温で10分間インキュベートする。
パラホルムアルデヒドを取り出し、井戸あたり1%TX-100の水に150マイクロリットルを加え、室温で30分間インキュベートします。TX-100を取り除くためにPBSで3回洗浄してください。蛍光を使用して組み込まれたEdUを検出するには、使用直前に96ウェルプレート当たり10ミリリットルのラベリング溶液を、正しい順序でストック溶液から試薬を追加します:20マイクロリットルTHPTA、20マイクロリットル硫酸銅、5マイクロリットルフルオレセインピコリ酸アジド、100マイクロリットルのアスコル化ナトリウムをPBSに100マイクロリットルの合計10リットルの添加します。
最も重要な手順は、使用する直前にラベリング ソリューションを作成することです。井戸からPBSを取り除き、各ウェルに150マイクロリットルのラベリング溶液を加え、摂氏37度で30分インキュベートします。すべての核を検出するには、蛍光顕微鏡またはイメージングプレートリーダー上の各ウェルと画像にDAPIを追加します。
手動カウントを避けるために、イメージングプレートリーダーが利用できない場合、このプロトコルはHRPアジドとELISA基板を使用して発光読み出しに変更することができます。発光を使用してEdUを検出するには、最初に0.1%ポリソルベート20でトリスバッファラインを調製します。その後、各ウェルに150マイクロリットルのブロッキングバッファーを加え、室温で90分間インキュベートします。
ブロッキングバッファーを取り外した後、200マイクロリットルのPBSで細胞を3回洗浄します。組み込まれたEdUを検出するには、最初に正しい順序でストック溶液から試薬を添加することにより、96ウェルプレートあたり10ミリリットルのラベリング溶液を調製します。まず、20マイクロリットルTHPTA、次いで20マイクロリットルの硫酸銅、5マイクロリットルのビオチンピコリルアジド、100マイクロリットルのアスコルビン酸ナトリウムをPBSに10ミリリットルの総容量で用いた。
200マイクロリットルのTBSTで5回3分の井戸を揺らします。室温で20分間0.3%過酸化水素の150マイクロリットルの内因性ペルオキシダーゼをクエンチ。過酸化水素を取り除いた後、200マイクロリットルのTBSTで5回3分間、振盪して洗浄します。
TBSTに50マイクロリットルの希釈ストレプトアビジン・ホースラディッシュペルオキシダーゼを各ウェルに加え、室温で1時間インキュベートします。200マイクロリットルのTBSTで5回3分洗浄します。50マイクロリットルの化学発光ELISA基板を各ウェルに加え、発光を検出できるプレートリーダーですぐに読み取ります。
蛍光核は、標準的な蛍光プレートリーダーで検出することができるが、発光プロトコルを使用して、蛍光スキャンは、ストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼおよび標準的なELISA基質で検出された均質な液体読み出しに変換される。この方法の利点は、蛍光読み出しと比較して、より均質な読み出しであり、PDGFに応答してVSMCの増殖を測定した場合に、ここで見られるようにプレートを数秒で読み取ることができる。欠点は、背景が蛍光よりも高く、したがって陰性のコントロールが高くなる傾向にあるということです。
変動性を減少させようと、結果を初期細胞数に正規化した。しかし、別の実験のセットでは、この方法は細胞数の小さな違いを検出するのに十分な感度ではないことを示した。EdU陽性および総細胞を数える最も効率的で正確な方法は、イメージングプレートリーダーを使用することです。
このタイプのプレートリーダーが使用できない場合、手動カウントでも正確な結果が得られます。これら 2 つの方法を比較する場合、EdU 正の手動カウントは、非刺激カウントの合計と同じで、自動化されたカウントと同じでした。これらの2つの方法の利点は、カウントされる細胞の可視性、精度の向上、および破片の非特異的染色が見られ、回避できることである。
手動棚卸方法の主な欠点は時間です。使用直前にラベリングソリューションを新鮮にし、書面で提供される順序で成分を追加することを忘れないでください。染色の強度が薄い場合は、キレートを銅比に調整してみてください。
パラホルムアルデヒドは有毒であることを覚えておいてください。手袋を着用しながら、ヒュームフードに使用する必要があります。手順自体は難しくないが、ラベリング溶液の銅比にキレートを調整することによって最適化する必要があるかもしれません。
また、EU治療のインキュベーション時間と長さは、細胞の種類や尋ねられる具体的な質問に応じて調整することができます。この技術は細胞表面と細胞内染色と相性が高く、分裂細胞や非分裂細胞の特性を判断することができる。一般的に増殖を測定するために使用されますが、クリック化学は、RNA、タンパク質、脂肪酸および炭水化物の代謝標識にも使用することができます。
対象となる代謝ターゲットが細胞表面上にある場合、生細胞に標識を付けることができる。
