この方法は、ミルク吸引が脳内のストレスシグナル伝達に影響を与える方法について、出生後の発達分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術は、最初の自然飢餓期間中に特定の脳領域をキャプチャし、最初の自然初乳フィードの直後にそれぞれの領域と比較するために使用することができます。吸引が行動や感情の生理学にどのような影響を与えるかを理解することで、元生体内脳組織分析中に様々な受容体に対するアンタゴニストの使用が可能になります。
核パンチを得るために、手袋をした手で尾でラットの子犬を取り除きます。脳を収穫した後、迅速に室温でポリメチルメタクリレート脳型に臓器全体を配置し、すぐに組織の500マイクロメートルの厚いスライスを作るために新しいカミソリの刃を使用します。スライスのロストラルをペトリ皿に置き、セクションの正しい方向を維持します。
脳全体が切り離されると、ブドウ糖のない人工脳脊髄液を素早く皿に加え、28~30°Cで60分間、軌道シェーカーで一定の攪拌を行います。各組織に脳アトラスと解剖学的ランドマークを使用して、パンチされる脳核を特定し、新しいペトリ皿に関心のある核を持つスライスを解剖顕微鏡の下に置きます。一度視覚化したら、4~6個の異なる核を素早く打ち抜き、プロテウス阻害剤とホスファターゼ阻害剤を含む適切な標識されたマイクロ遠心分離管に各パンチ核を0.06mLの氷冷タンパク質抽出バッファーに迅速に浸漬します。
インキュベーションの終わりに、抽出した核を冷却されたミニ遠心分離機で遠心分離し、マイクロピペットを使用して、各チューブから適切な予熱1.5mLマイクロ遠心分離管に0.055mLの上清を慎重に移します。マイナス20°Cの貯蔵前に、各タンパク質ストックチューブから、最初のサンプル調製のために氷上の適切な0.5 mL事前冷却チューブに上清の0.012 mLを移します。毛細管内タンパク質測定用のサンプルを準備するには、0.5 mLラベルチューブ内の各サンプルに、タンパク質のリシスキットから0.003 mLのマスターミックス試薬を追加します。
次に、0.016 mLの脱イオン水中のビオチン化分子量ラダー溶液に0.004mLのマスターミックス試薬を加え、ラダーとタンパク質抽出サンプルを摂氏95度の熱塊で変性させ、5分後にすべてのチューブを摂氏4度で保存します。シグナルタンパク質分析のために、新しい自動化された西洋プレートのウェルE-1からE-25、D-25への二次抗マウス抗体の0.01 mLに作りたてのルミノール過酸化物溶液0.01 mLを加え、キットからD-1-ウェルに0.01 mLのストレプトアビジン・ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼを加える。作製した初等抗体の0.01 mLをC-25にウェルC-2に加え、0.01 mLの抗体希釈液をウェルC-1とB-1からB-25に加えます。
行Fウェルを空のままにし、F行の下の3つの行の5つのコンパートメントを0.45 mLの洗浄バッファで満たします。次に、冷蔵サンプルを30秒間簡単に回転させ、各サンプルの0.03 mLをA-2から始めて行Aの各ウェルに追加します。その後、ビオチン化分子量ラダーの0.005 mLをA-1ウェルに加え、遠心分離のためにプレートを覆います。
プレートが遠心分離されている間、自動化された西洋関連ソフトウェアで新しい実行ファイルを開き、分子サイズアッセイを開始します。アッセイページでは、サンプル名を各毛細血管に入力し、一次抗体と二次抗体の名前を入力します。遠心分離の終わりに、自動西洋の器具にプレートを置き、キャピラリーカートリッジボックスからカバーを剥がします。
遠心分離の後、毛細管の気泡が電気泳動電流を遮断し、ラウンド全体に失敗する可能性があるため、気泡がないか検査することを忘れないでください。カートリッジを器具内の指定位置に挿入し、ドアを閉めます。[開始] をクリックします。
アッセイの種類を求められたら、適切なテキストボックスに実験の名前を入力し、[大丈夫]をクリックします。アクティブ化された実行日付と実行ファイルの ID 番号が表示されたら、実行が終了した時刻をメモします。走行の終了時に、キャピラリーカートリッジをシャープ処分に廃棄し、プレートを生体有害物質の処分に廃棄します。
電気泳動分離後、リン酸化真核生物翻訳開始因子2Aを表す40〜43キロダルトンで抗原の免疫反応性ピークを実行ファイルで確認します。このサイズの分子量のピークが欠落している場合は、カーブの下を右クリックし、曲線の下のサイズと任意の量が記録されるように、ピークに分子量を追加を選択します。未形成組織サンプル内では、孤独なトラックの核中の結合アミノグロブリンタンパク質レベルは、他のすべての領域と比較して有意に高い。
初乳を有する腸組織のプライミングは、孤独なトラックの核中の結合性アミノグロブリンタンパク質レベルを減少させ、パラベントリク核および超光学核に影響を及ぼさない。逆に、プライミングは、未形成組織に対する皮質内の結合性アミノグロブリンタンパク質レベル、ストリエーション核および内側プレオプティック核を増加させ、種々の試験された脳核における結合性アミノグロブリンタンパク質レベルが腸のプライミングに異なる反応を示すことを示唆し、試験された様々な核間のクロストークはまだ実証されていない。真核翻訳開始因子2Aおよびリン酸化真核生物翻訳開始因子2Aレベルは、他の核に対して未形成状態で上昇する。
プライミング後、真核翻訳開始因子2Aおよびリン酸化真核生物翻訳開始因子2Aの両方のレベルは、未プライメーション組織と比較して、孤独なトラックの核に対して減少する。他のすべての試験核において、プライミングは、真核生物翻訳開始因子2Aおよびリン酸化真核生物翻訳開始因子2Aのレベルを未プライメーション組織に対して増加させる。しかしながら、リン酸化タンパク質キナーゼ受容体のレベルは、単一のトラックの核におけるプライミングされたサンプルに対して、未プライミングサンプルにおいて低く、真核翻訳開始因子2Aのリン酸化に別のキナーゼが関与していることを強く示唆している。
その開発後、この技術は、出生後の発達の分野の研究者が、組織の成長と分化に関与するシグナル伝達経路と、それらが吸引の影響を受けるか独立しているかを探求する道を開いた。例えば、ジチオスレイトールのような揮発性還元剤を使用すると危険であり、この手順を準備する際には、化学フード内の準備などの予防措置を常に取るべきであることを忘れないでください。
