Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области послеродового развития о том, как сосание молока влияет на стресс сигнализации в головном мозге. Этот метод может быть использован для захвата конкретных областей мозга в течение первого периода естественного голодания и сравнить их с соответствующими областями вскоре после первого естественного молозива корма. Понимание того, как сосание влияет на физиологию поведения и эмоций, позволяет использовать антагониста для различных рецепторов во время анализа тканей мозга ex-vivo.
Чтобы получить ядра ударов, удалить крыс щенков за хвост с перчаткой стороны. После сбора мозга, быстро поместите весь орган в полиметил метакрилат головной формы при комнатной температуре и сразу же использовать новый лезвие бритвы, чтобы сделать 500 микрометров толщиной ломтики ткани. Положите ломтики рострал в caudal в чашку Петри, как они получены для поддержания правильной ориентации разделов.
Когда весь мозг был секционен, быстро добавить искусственную спинномозговую жидкость без глюкозы в блюдо и инкубировать ломтики в течение 60 минут при 28 до 30 градусов по Цельсию с постоянным перемешиванием на орбитальном шейкере. Используйте атлас мозга и анатомические ориентиры на каждой ткани, чтобы определить ядра мозга, которые будут пробиты, и поместить кусочек с ядрами, представляющими интерес, в новую чашку Петри под рассеченным микроскопом. После визуализации используйте инструмент coring, чтобы быстро пробить четыре-шесть различных ядер и быстро погрузить каждое пробитое ядро в 0,06 мл буфера извлечения холодного белка льда в соответствующе помеченной микро-центрифуге трубки, содержащей ингибиторы протея и ингибиторы фосфатазы в течение 60 минут.
В конце инкубации центрифугайте извлеченные ядра в охлажденой мини-центрифуге и используйте микро-пипетку, чтобы тщательно перенести 0,055 мл супернатанта из каждой трубки в соответствующую предварительно охлаждено 1,5 мл микро-центрифуги трубки на льду. Перед отрицательным 20 градусов по Цельсию хранения, передача 0,012 мл супернатанта из каждой трубки запас белка в соответствующие 0,5 мл предварительно охлажденой трубки на льду для подготовки первого образца. Чтобы подготовить образцы для измерения белка в капилляре, добавьте 0,003 мл реагента мастер-микса из набора белкового лиза к каждому из образцов в 0,5 мл помеченных трубок.
Далее добавьте 0,004 мл реагента мастер-микса в биотинилированный молекулярный раствор лестницы веса в 0,016 мл деионизированной воды, а также денатурацию лестницы и образца экстракта белка в тепловом блоке 95 градусов по Цельсию, сохраняя все трубки при четырех градусах Цельсия через пять минут. Для анализа сигнального белка добавьте 0,01 мл свежеприготовленного раствора перекиси люминола в скважины Е-1 к Е-25 новой автоматизированной западной пластины, 0,01 мл вторичного антимошешного антитела к скважинам D-2 к D-25 и добавьте 0,01 мл стрептавидина хрена пероксидазы из комплекта в скважину D-1. Добавьте 0,01 мл свежеприготовленного первичного антитела в скважины С-2 к С-25 и 0,01 мл раствора антител, разбомбив два раствора скважин С-1 и В-1 до В-25.
Оставьте ряд F колодцев пустыми и заполните пять отсеков из трех рядов ниже F строки с 0,45 мл буфера мытья. Затем кратко вращайте охлажденные образцы в течение 30 секунд и добавляйте 0,03 мл каждого образца к каждому колодец строки А, начиная с A-2. Затем добавьте 0,005 мл биотинилированной молекулярной весовой лестницы в колодец А-1 и накройте пластину центрифугой.
В то время как пластина центрифугирована, откройте новый файл запуска в автоматизированном западном связанном программном обеспечении и инициировать анализ молекулярного размера. На странице анализа введите имена образцов в каждый капилляр, а также названия первичных и вторичных антител. В конце центрифугации поместите пластину в автоматизированный западный инструмент и очистите крышку от капиллярного картриджа.
После центрифугации, не забудьте проверить на пузырьки воздуха, потому что пузырьки воздуха в капилляре может блокировать электрофоретический ток и не весь раунд. Вставьте картридж в назначенное положение внутри прибора и закройте дверь. Нажмите кнопку "Начать".
При запросе с типом анализа, введите название эксперимента в соответствующем текстовом поле и нажмите хорошо. По запросу активированной даты запуска и идентификационного номера в файле запуска сделайте заметку о времени окончания запуска. В конце пробега выбросьте капиллярный картридж в распоряжение острыми и пластины в распоряжение биоопасных материалов.
После разделения электрофореза проверьте файлы бега на наличие пиков иммунной реактивности антигенов на уровне от 40 до 43 килодальтонов, которые означает фосфорилированный эукариотический фактор инициации перевода 2A. Там, где молекулярные пики веса такого размера отсутствуют, нажмите прямо ниже кривой и выберите добавить молекулярный вес к пику, чтобы гарантировать, что размеры и произвольные количества ниже кривой регистрируются. В образцах ткани unprimeds, связывающие уровни белка аминокислоты глобулина в ядрах одиночного трека значительно выше по сравнению со всеми другими регионами.
Примыкать ткани кишечника молозивом снижает связывающие уровни белка аминоглобулина в ядрах одиночного пути и не влияет на паравентрикулярные ядра и супероптические ядра. И наоборот, грунтовка увеличивает связывающие уровни белка аминоглобулина в коре головного мозга, ядрах стриации и медиальных предоптических ядрах по отношению к непремеченной ткани, подразумевая, что связывающие уровни белка аминокислотного глобулина в различных проверенных ядрах мозга по-разному реагируют на грунтовку кишечника, и пока нет никакого продемонстрированого перекрестного разговора между различными проверенными ядрами. Эукариотический коэффициент инициации перевода 2A и фосфорилированный эукариотический коэффициент инициации перевода 2A повышены в нестандартном состоянии по сравнению с другими ядрами.
После грунтовки, уровни как эукариотического фактора инициации перевода 2A, так и фосфорилированного эукариотического фактора инициации перевода 2A снижаются по сравнению с ядрами одиночного трека по сравнению с непременной тканью. Во всех других проверенных ядрах грунтовка повышает уровень эукариотического фактора инициации перевода 2A и фосфорилированного эукариотического фактора инициации перевода 2А по отношению к непременной ткани. Тем не менее, уровни рецептора фосфорилированной протеиновой киназы низки в непременных образцах по сравнению с загрунтованные образцы в ядрах одиночного трека, что убедительно свидетельствует о том, что другой киназы участвует в фосфорилировании эукариотического фактора инициации перевода 2A.
После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей в области послеродового развития для изучения сигнальных путей, участвующих в росте тканей и дифференциации и являются ли они под влиянием или независимо от сосания. Не забывайте, что работа с летучими снижая агентов, как, например, дитиотрейтол, может быть опасным, и меры предосторожности, такие как подготовка в химическом капюшоне всегда должны быть приняты при подготовке этой процедуры.
