Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo de desenvolvimento pós-natal sobre a forma como a amamentação do leite influencia a sinalização de estresse no cérebro. Esta técnica pode ser usada para capturar áreas cerebrais específicas durante o primeiro período natural de fome e compará-las com respectivas áreas logo após a primeira alimentação natural do colostro. Entender como mamar influencia a fisiologia do comportamento e da emoção permite o uso de um antagonista a vários receptores durante a análise do tecido cerebral ex-vivo.
Para obter os socos dos núcleos, remova os filhotes de rato pela cauda com uma mão enluvada. Depois de colher o cérebro, coloque rapidamente todo o órgão em um molde cerebral de metacrilato de polimetil à temperatura ambiente e use imediatamente uma nova lâmina de barbear para fazer fatias de 500 micrômetros de espessura do tecido. Coloque as fatias rostral para caudal em uma placa de Petri como elas são obtidas para manter a orientação correta das seções.
Quando todo o cérebro for seccionado, adicione rapidamente fluido espinhal cerebral artificial sem glicose ao prato e incuba as fatias por 60 minutos a 28 a 30 graus Celsius com agitação constante em um agitador orbital. Use um atlas cerebral e marcos anatômicos em cada tecido para identificar os núcleos cerebrais a serem perfurados e colocar a fatia com os núcleos de interesse em uma nova placa de Petri sob um microscópio dissecando. Uma vez visualizado, use uma ferramenta de coring para perfurar rapidamente quatro a seis núcleos diferentes e imergir rapidamente cada núcleo perfurado em 0,06 mL de tampão de extração de proteína gelada no tubo de microcrífugo apropriadamente rotulado contendo inibidores de protes e inibidores de fosfatase por 60 minutos.
No final da incubação, centrifugar os núcleos extraídos em uma mini centrífuga resfriada, e usar uma micro-pipeta para transferir cuidadosamente 0,055 mL de supernacer de cada tubo para o tubo de microcrédito de 1,5 mL pré-resfriado apropriado no gelo. Antes do armazenamento negativo de 20 graus Celsius, transfira 0,012 mL de supernadante de cada tubo de estoque de proteínas para o tubo pré-resfriado apropriado de 0,5 mL no gelo para a primeira preparação da amostra. Para preparar as amostras para a medição da proteína in-capilar, adicione 0,003 mL de reagente de mistura mestre de um kit de lise proteica a cada uma das amostras nos tubos rotulados de 0,5 mL.
Em seguida, adicione 0,004 mL de reagente de mistura mestre a uma solução de escada de peso molecular biotinína em 0,016 mL de água desionizada, e desnaturar as amostras de extrato de escada e proteína em um bloco de calor de 95 graus Celsius, armazenando todos os tubos a quatro graus Celsius após cinco minutos. Para análise de proteína de sinal, adicionar 0,01 mL de solução de peróxido de luminol recém-preparada aos poços E-1 a E-25 de uma nova placa ocidental automatizada, 0,01 mL de anticorpo anti-rato secundário aos poços D-2 a D-25, e adicionar 0,01 mL de peroxidase de rabanete streptavidin do kit para bem D-1. Adicione 0,01 mL de anticorpo primário recém-preparado nos poços C-2 a C-25, e 0,01 mL de anticorpo diluiente duas soluções para os poços C-1 e B-1 a B-25.
Deixe os poços F de linha vazios e encha os cinco compartimentos das três linhas abaixo da linha F com 0,45 mL de tampão de lavagem. Em seguida, gire brevemente as amostras refrigeradas por 30 segundos e adicione 0,03 mL de cada amostra a cada poço da linha A, começando com A-2. Em seguida, adicione 0,005 mL da escada de peso molecular biotinilada até bem A-1 e cubra a placa para centrifugação.
Enquanto a placa é centrifugada, abra um novo arquivo de execução no software associado ocidental automatizado e inicie um ensaio de tamanho molecular. Na página de ensaio, insira os nomes da amostra em cada capilar, bem como os nomes dos anticorpos primários e secundários. No final da centrifugação, coloque a placa no instrumento ocidental automatizado e retire a tampa da caixa do cartucho capilar.
Após a centrifugação, não se esqueça de inspecionar bolhas de ar, pois bolhas de ar no capilar podem bloquear a corrente eletroforética e falhar toda a rodada. Insira o cartucho na posição designada dentro do instrumento e feche a porta. Clique em iniciar.
Quando solicitado com o tipo de ensaio, digite o nome do experimento na caixa de texto apropriada e clique em ok. Quando solicitado pela data de execução ativada e pelo número de identificação no arquivo de execução, anote o momento em que a execução termina. No final da corrida, descarte o cartucho capilar no descarte de nitidez e a placa no descarte de materiais de risco biológico.
Após a separação da eletroforese, verifique os arquivos de execução para picos de reatividade imunológica de antígenos em 40 a 43 kilodaltons que representam o fator de iniciação da tradução eucariótica fosforilado 2A. Onde faltam picos de peso molecular deste tamanho, clique com o botão direito do mouse abaixo da curva e selecione adicionar peso molecular ao pico para garantir que os tamanhos e quantidades arbitrárias abaixo da curva sejam registrados. Dentro das amostras de tecido unprimeds, os níveis de proteína de amino globulina nos núcleos da pista solitária são significativamente maiores em comparação com todas as outras regiões.
A escorraça do tecido intestinal com colostro diminui os níveis de proteína de amino globulina nos núcleos da pista solitária e não tem efeito sobre núcleos paraventriculares e núcleos super-ópticos. Por outro lado, o escoramento aumenta os níveis de proteína de amino globulina de ligação dentro do córtex, núcleos de estriação e núcleos preópticos medial em relação ao tecido não primogêntico, implicando que os níveis de proteína de amino globulina nos vários núcleos cerebrais testados respondem de forma diferente ao estripamento intestinal e ainda não há qualquer conversa cruzada demonstrada entre os vários núcleos testados. Fator de iniciação da tradução eucariótica 2A e fator de iniciação de tradução eucariótica fosforilado fator 2A são elevados na condição não primogêntica em relação a outros núcleos.
Após o priming, os níveis de iniciação de tradução eucariótica 2A e fator de iniciação de tradução eucariótica fosforilado 2A são reduzidos em relação aos núcleos da faixa solitária em comparação com o tecido não primogênito. Em todos os outros núcleos testados, o priming aumenta os níveis de iniciação de tradução eucariótica 2A e fator de iniciação de tradução eucariótica 2A em relação ao tecido não primogênito. No entanto, os níveis de receptor de proteína fosfoilada quinase são baixos em amostras não primed em relação a amostras preparadas em núcleos da faixa solitária, sugerindo fortemente que outra quinase está envolvida na fosforilação do fator de iniciação de tradução eucariótica 2A.
Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo do desenvolvimento pós-natal explorarem as vias de sinalização envolvidas no crescimento e diferenciação tecidual e se são influenciadas ou independentes da amamentação. Não se esqueça que trabalhar com agentes de redução voláteis como, por exemplo, dithiothreitol, pode ser perigoso, e precauções como a preparação na capa química devem ser sempre tomadas na preparação deste procedimento.
