私の研究室では、乳癌や肺癌におけるカバ経路の役割を研究しており、最近ではカバのシグナリング活性を監視する新しいバイオセンサーを開発しました。この方法は、Hippo経路が因子にどのように反応するか、および他のシグナル伝達経路とどのように相互作用するかなど、細胞信号ネットワークに関する重要な質問に答えるために使用できます。既存の方法よりもこの技術の主な利点は、その大きな感度とサンプルの多数を迅速かつ同時に処理することができます。
この技術は、インビトロとインビボの両方のHippoシグナル伝達経路の調節因子を調査するための基礎的および翻訳研究において多様な応用を有する。まず、DH5-アルファ菌液培養から新鮮なミニプレップLATS-BSプラスミド。トランスフェクションの1時間前に、プレートから培地を吸引し、各ウェルに500マイクロリットルの成長培地を加える。
1つの重要なポイントは、最大の発現と活性を得るためにLATSバイオセンサーを新鮮に準備する必要があります。また、ルシファーゼアッセイを行う際には、MSDなどのヒッポ経路の上流レギュレータを正のコントロールとして常に使用することをお勧めします。この後、細胞をインキュベーターに戻す。
次に、溶液A、DNA溶液、及び溶液Bを、テキストプロトコルに記載される、希釈ポリマー系トランスフェクション試薬を調製する。この後、溶液Bを溶液Aに直ちに添加し、ピペットを上下に軽く混ぜ合わせます。サンプルを室温で15分間インキュベートし、トランスフェクション複合体を形成させます。
次に、穏やかな渦巻きでプレートの各ウェルに滴下トランスフェクション複合体の総体積を追加します。細胞を摂氏37度で一晩インキュベートする。翌日、トランスフェクション複合体含有培地を取り出し、新しい完全な培地に交換します。
その後、さらに1日摂氏37度で細胞を培養します。5倍の受動リシスバッファーを蒸留水で適切な量の希釈します。その後、プレートから培地を完全に吸引する。
各ウェルにPBSを1ミリリットル加え、プレートをそっと旋回させて、剥離した細胞と残留成長培地を取り除きます。その後、PBSを完全に吸引します。次に、各ウェルに250マイクロリットルの1xPLBを加えます。
15分間ロッキングプラットフォーム上に培養プレートを置き、PLBで細胞単層のカバレッジを均等にします。この後、1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブにリゼートを移します。80°CのストレージからLAR-2を取り出し、室温に平衡化します。
次に、レニラ検出試薬を適量のアッセイ用に調製します。50x基板とそのバッファーにレニラ検出試薬を加えます。次に、各細胞の10マイクロリットルを1.5ミリリットルのチューブに分配する。
次いで、2秒前測定遅延を行い、続いて10秒の測定期間を実行するようにルミノメーターをプログラムする。慎重に、LAR-2試薬の20マイクロリットルを1つのチューブに移し、ピペットを上下に素早く混合します。その後、すぐにチューブをルミノメーターに入れ、読み取りを開始します。
読み取り後、ルミノメーターからサンプルチューブを取り出し、20マイクロリットルのレニラ試薬を加え、ピペットを上下に混ぜます。次に、サンプルをルミノメーターに入れ、次の読み取りを開始します。まず、テキストプロトコルに記載されているように、培養、剥離、カウント、およびプレートHEK293 Ad-Cells。
次いで、トランスフェクションの1時間前に、プレートから培地を吸引し、5ミリリットルの新鮮な完全成長培地に交換する。最後に、希釈溶液Bを溶液Aに加え、ピペットを上下に加え、混合する。次に、サンプルを室温で15分間インキュベートしてから、トランスフェクション複合体の総体積をプレートに加え、穏やかに旋回しながら行います。
細胞を摂氏37度で一晩インキュベートする。翌日、細胞をトリプシン化して数えます。プレート10,000〜20,000細胞は、ウェルあたり100マイクロリットルの培地の合計体積で96ウェルプレートの各ウェルに入る。
この後、細胞をもう1日インキュベートします。ルシファーゼアッセイを行う1〜4時間前に、カバ経路を調節する可能性のある薬剤を、井戸当たり10マイクロモルの最終濃度で添加する。次に、培地を細胞から完全に吸引し、各ウェルの細胞を100マイクロリットルのPBSで洗浄する。
その後、各ウェルにPLBの20マイクロリットルを追加します。15分間、ロッキングプラットフォームの上に培養プレートを置きます。次いで、20マイクロリットルのLAR-2試薬をプレートの各ウェルに移し、ピペットを上下に混合した。
この直後にプレートをプレート読み取りルミノ計に入れ、読み取りを開始します。このプロトコルの最初の部分では、LATS-BSは、LATSキナーゼ活性に対するその効果を評価するために、異なる遺伝子と共感染した。第2のプロトコルでは、LATS-BSをHEK293-Adにトランスフェクションし、細胞を96ウェルプレートに渡した。
トランスフェクションの40時間後、細胞を、ヒッポシグナル伝達の異なる既知の小分子調節因子で処理し、続いてルシファーゼアッセイを行った。これらのアッセイの結果を解釈する場合、タンパク質および薬物治療は、バイオセンサ活性に影響を与えるフィードバック経路を活性化し得る。候補とカバのシグナル伝達経路との関係を確認するためには、さらなる実験が必要となる。
この手順に従って、定量的リアルタイムPCR、またはウェスタンブロットのような他の方法を使用して、LATSキナーゼ活性に関する追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、がん生物学の分野の研究者が、多くの生物学的および生化学的プロセスにおけるLATSキナーゼおよびカバシグナル伝達経路のダイナミクスと活性を探求する道を開いた。スクリーニングのための薬物は非常に危険であり、この手順を実行している間は常に適切な予防措置を講じるべきであることを忘れないでください。
