Mon laboratoire a étudié le rôle de la voie hippopotame dans le cancer du sein et du poumon, et récemment, nous avons développé un nouveau biocapteur pour surveiller l’activité de signalisation hippopotame. Cette méthode peut être utilisée pour répondre à des questions clés sur les réseaux de signalisation cellulaire, telles que la façon dont la voie Hippo réagit aux facteurs et comment elle interagit avec d’autres voies de signalisation. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est sa grande sensibilité et aussi le grand nombre d’échantillons peuvent être traités rapidement et simultanément.
Cette technique a diverses applications dans la recherche fondamentale et translationnelle pour étudier les régulateurs de la voie de signalisation Hippo à la fois in vitro et in vivo. Pour commencer, mini-préparation LATS-BS plasmides frais de la culture liquide bactéries DH5-Alpha. Une heure avant la transfection, aspirer le milieu de la plaque et ajouter 500 microlitres de milieu de croissance à chaque puits.
Un point important est que le biocapteur LATS doit être préparé frais afin d’obtenir un maximum d’expression et d’activité. En outre, il est recommandé d’utiliser toujours un régulateur en amont de la voie hippopotame, comme msd, comme un contrôle positif lors de l’exécution de l’analyse de luciferase. Après cela, retourner les cellules à l’incubateur.
Ensuite, préparez la solution A, une solution d’ADN, et la solution B, un réaccérateur transfection dilué à base de polymère, tel que décrit dans le protocole de texte. Après cela, ajoutez immédiatement la solution B à la solution A, et pipette doucement de haut en bas pour mélanger. Incuber l’échantillon à température ambiante pendant 15 minutes pour permettre aux complexes de transfection de se former.
Ajoutez ensuite le volume total des complexes de transfection drop-wise à chaque puits de la plaque avec tourbillonnant doucement. Incuber les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, retirez les supports contenant du teint transfection et remplacez-les par des supports frais et complets.
Puis la culture des cellules à 37 degrés Celsius pour une journée de plus. Diluer une quantité appropriée de tampon de lyse passive 5x avec de l’eau distillée. Ensuite, aspirez complètement les médias de la plaque.
Ajouter un millilitre de PBS à chaque puits et faire tourbillonner doucement la plaque pour enlever les cellules détachées et les supports de croissance résiduels. Ensuite, aspirez le PBS complètement. Ensuite, ajoutez 250 microlitres de 1xPLB à chaque puits.
Placez la plaque de culture sur une plate-forme de basculement pendant 15 minutes pour assurer une couverture même de la monocouche cellulaire avec PLB. Après cela, transférer le lysate dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre. Retirez le LAR-2 de l’espace de stockage de 80 degrés Celsius et équilibrez-le à température ambiante.
Ensuite, préparez le réaccente de détection Renilla pour une quantité appropriée d’analyses. Ajouter le réaccente de détection Renilla au substrat 50x et à son tampon. Ensuite, distribuez 10 microlitres de chaque cellule lysate en tubes de 1,5 millilitre.
Ensuite, programmez un luminomètre pour effectuer un délai de pré-mesure de deux secondes, suivi d’une période de mesure de 10 secondes. Transférer soigneusement 20 microlitres de réaccente LAR-2 dans un seul tube, et rapidement pipette de haut en bas pour mélanger. Ensuite, placez immédiatement le tube dans le luminomètre et lancez la lecture.
Après la lecture, retirer le tube d’échantillon du luminomètre, ajouter 20 microlitres de réaccente Renilla, et pipette de haut en bas pour mélanger. Ensuite, placez l’échantillon dans le luminomètre et lancez la lecture suivante. Tout d’abord, la culture, détachez, comptez et plaquez les cellules Ad HEK293 telles que décrites dans le protocole texte.
Puis, une heure avant la transfection, aspirez le média de la plaque et remplacez-le par cinq millilitres de nouveaux supports de croissance complets. Enfin, ajoutez la solution diluée B à la solution A, et pipette de haut en bas pour mélanger. Ensuite, incuber l’échantillon à température ambiante pendant 15 minutes avant d’ajouter le volume total des complexes de transfection à la plaque, tout en tourbillonnant doucement.
Incuber les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, essayez et comptez les cellules. Plaque 10 000 à 20 000 cellules dans chaque puits d’une plaque de 96 puits dans un volume total de 100 microlitres de médias par puits.
Après cela, incuber les cellules pendant une journée de plus. Une à quatre heures avant d’effectuer l’analyse de luciferase, ajouter des agents régulant potentiellement la voie hippopotame, à une concentration finale de 10 micromolaires par puits. Ensuite, aspirez complètement le média des cellules et lavez les cellules dans chaque puits avec 100 microlitres de PBS.
Ajouter ensuite 20 microlitres de PLB à chaque puits. Placez la plaque de culture sur une plate-forme de basculement pendant 15 minutes. Ensuite, transférez 20 microlitres de réaccente LAR-2 à chaque puits de la plaque, et pipette de haut en bas pour mélanger.
Immédiatement après cela, placez la plaque dans un luminomètre à lecture de plaques et lancez la lecture. Dans la première partie de ce protocole, le LATS-BS a été cotransfecté avec différents gènes pour évaluer leur effet sur l’activité de kinase de LATS. Dans le deuxième protocole, LATS-BS a été transfecté dans HEK293-Ad, et les cellules ont été passées dans les plaques de 96 puits.
40 heures après transfection, les cellules ont été traitées avec différents régulateurs connus de petite molécule de signalisation d’Hippo, suivi d’un essai de luciferase. Lors de l’interprétation des résultats de ces analyses, il convient de noter que les protéines et les traitements médicamenteux peuvent activer les voies de rétroaction qui influencent l’activité des biocapteurs. D’autres expériences seront nécessaires pour confirmer une relation entre le candidat et la voie de signalisation hippopotame.
Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme le PCR en temps réel quantitatif, ou Western Blot, peuvent être utilisées pour répondre à d’autres questions sur l’activité de kinase LATS. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie du cancer pour explorer la dynamique et l’activité de la kinase LATS et de la voie de signalisation hippopotame dans de nombreux processus biologiques et biochimiques. N’oubliez pas que les médicaments pour le dépistage peuvent être extrêmement dangereux, et des précautions appropriées doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.
