この作品はR01 DC013339、R03 DC011373、ルースL.キルシュシュタイン国立研究サービス賞T32 DC000014によってサポートされていました。作品の一部は、NIH-NIDCDコアグラントをP30 DC011735からの資金によって部分的にサポートされていモネル化学感覚受容体シグナルコアを用いて行った。著者は、データ収集のヘルプのために-80 Sezilleに感謝します。

1。Hana3A細胞の培養に<ol><li> 10％（V / V）FBSを最小必須培地（MEM）を補完することにより、M10のメディアを準備します。 </li><li>培養維持<ol><li> M10培地中で細胞を維持する。注：RTP1L、RTP2、REEP1、Gのための発現ベクターは、Hana3A細胞にピューロマイシン耐性を付与するαolfますが、この抗生物質で細胞を維持することは、大幅に検定結果には影響しません。 </li><li> 10cmの皿で1:8の比率を2〜3日ごとにサブカルチャー。 </li><li> 5％のCO 2、37℃でインキュベートする。 </li></ol></li></ol> 2。トランスフェクションのために細胞をプレーティング<ol><li> Hana3A細胞を100％コンフルエント10cmディッシュから培地を吸引。 </li><li> 、10mlのPBSを加える料理を旋回し、PBSを吸引して細胞を洗浄します。 </li><li> 0.05％トリプシン/ EDTAの3ミリリットルを加え、細胞が（約1分）解離するのを待ちます。 </li><li> 5ミリリットルM10を追加することにより、トリプシンを不活性化し、およそ10倍＆を粉砕することにより、細胞塊を壊す＃160; 10ミリリットルピペットで。ピペットを慎重にメディアに気泡を導入しないようにします。 </li><li>各96ウェルプレートについて15ミリリットルに、転写1mlの細胞を円錐管、5分間、200×gで遠心分離し、細胞ペレットを乱すことなく上清を吸引する。 </li><li>ステップ2.5で導入細胞の1ミリリットルあたり6ミリリットルM10に細胞を再懸濁。 </li><li>ピペット96ウェルプレートの各ウェルに50μlの細胞と、5％CO 2、37℃で一晩インキュベートする。 </li></ol>嗅覚受容体の3。トランスフェクション<ol><li>プラスミドDNAの調製<ol><li>エンドトキシンフリーのプロトコルを介してプラスミドDNAを調製。注：指定された使用のプラスミドDNA調製用キット「エンドトキシンフリー」、またはプラスミドDNA調製プロトコルにフェノール - クロロホルム抽出工程を追加します。 </li><li> TE緩衝液中100 ngの/μLの濃度にDNAを希釈します。 </li></ol></li><li>近似​​の適切な集密度を確保するために播種した細胞（ステップ2.7）を観察tely 30-50ウェルあたり％、インキュベーターに戻ります。注：このフルエンシーは、脂質トランスフェクション試薬には最適ではないですが、この段階で30から50までパーセントの集密度は、トランスフェクション後のルシフェラーゼ活性の24時間を測定するために最適である。 </li><li>トランスフェクションミックスの調製<ol><li>プラスミドミックスするために、表1に詳述されたボリュームごとにMEM培地にピペットRTP1S-PCI、M3-R-PCI、のpCRE-LUCとしたpSV40-RLプラスミド（示さボリュームは96ウェルプレートあたりの金額です。） <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:356px;"><tbody><tr height="22"><td colspan="3" height="22" style="height:22px;width:356px;"> プラスミドミックス </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> ウェルあたり </td><td> 96ウェルプレート当たり </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> MEM </td><td> - </td><td> 500μL </td></tr><tr高さ= &quot;21&quot;&gt; <td height="21" style="height:21px;"> RTP1S-PCI </td><td> 5 NG </td><td> 480 NG </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> M3-R-PCI </td><td> 2.5 ngの</td><td> 240 NG </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;">のpCRE-LUC </td><td> 10 NG </td><td> 960 NG </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;">たpSV40-RL </td><td> 5 NG </td><td> 480 NG </td></tr></tbody></table> 表1。プラスミドミックス成 ​​分。ウェルあたりとRTP1S-PCI、M3-R-PCI、のpCRE-LUCとしたpSV40-RL、およびMEMの96ウェルプレートボリュームあたり。 </li><li>各96ウェルプレートについては、450μlのMEM培地中の18μlの脂質トランスフェクション試薬を希釈する。 </li><li>ピペットプラスミドミックス（ステップ3.3.1から）、PCIプラスミド（ロー-OR-PCI）におけるロドプシンタグ付き嗅覚受容体、および中複雑、詳細にする（ステップ3.3.2から）脂質トランスフェクションミックス<strong&gt;表2砕により溶液を混合し、15分間室温でインキュベートする。 表2によるM10を添加して反応を停止します。注：この反応は、時間と小文字が区別され、30分以上継続させてはいけません。ウェル+ 10％の計算は、後の工程のために十分な容積を確保することが重要である。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr height="21"><td colspan="3" height="21" style="height:21px;width:472px;"> 複雑な </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> ウェルあたり </td><td> ウェルあたり+10％ </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;">プラスミドミックス</td><td> 4.2μL </td><td> 4.58μL </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> ρ-OR-PCI </td><td> 0.05 NG </td><td> 0.06 NG </td></tr><tr高さ= &quot;21&quot;&gt; <td height="21" style="height:21px;">脂質トランスフェクションミックス</td><td> 4.2μL </td><td> 4.58μL </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> M10 </td><td> 41.7μL </td><td> 45.83μL </td></tr></tbody></table> 表2。複合成分。ウェル当たり、プラスミド混合物（ 表1）のウェル+ 10％の量、嗅覚受容体プラスミド（Rho-イソたpCI-OR）、および脂質トランスフェクション混合物あたり。 M10を室温で15分間のインキュベーション後、反応をクエンチするために添加される。 </li></ol></li></ol><ol start="4"><li>細胞プレート上のメディアをタップします。 </li><li>ピペット50を各ウェルに複合μlの5％CO 2、37℃で一晩インキュベートする。 </li></ol> 4。臭気刺激<ol><li>ウェルあたり50〜80パーセントの適切​​な集密度を確保するために、トランスフェクションされた細胞を観察し、インキュベーターに戻す。注：細胞は、50未満である場合％コンフルエント、ホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼ読み取りは、受容体活性化の測定のためには低すぎるであってもよい。プレートを捨てることを検討してください。 </li><li> DMSO中の各臭気の1Mのストック溶液を準備します。 </li><li> CD293培地中の匂い刺激溶液を準備します。 <ol><li>スクリーニング実験のために、100μMまで匂いの原液を希釈。また、（のみCD293）またはバックグラウンド活性化のために制御するために、無臭気制御を準備します。注：実験をスクリーニングするために、各OR /臭気ペアは一度だけ、実験ごとにテストされています。井戸間でいくつかの臭気の拡散が可能なので、各プレートについて1着臭剤で刺激することをお勧めします。 </li><li>用量反応実験のために、各受容体のために1 mMのから始まる三重で臭気原液の7の10倍連続希釈液を調製する。また、臭気の背景活性化のために制御するために、空のベクターをトランスフェクトした細胞のための三重に同じ匂い希釈液を調製する。 NOTE：用量応答実験のために、それぞれODOR濃度処理が3回実施されるべきである。 </li></ol></li><li>細胞プレート上のメディアをタップします。 </li><li>ピペット各ウェルに匂い刺激溶液25μlと4時間インキュベートすること。 </li></ol>ルシフェラーゼアッセイを経由して5。測定又は活動<ol><li> -80℃で、製造元の指示や店舗ごとに再懸濁し、ホタルルシフェラーゼ基質</li><li> 96ウェルプレート当たりホタルルシフェラーゼ基質1mlの解凍する。 </li><li>クエンチャー新鮮ホタルルシフェラーゼ反応を準備し、 ウミシイタケルシフェラーゼ基質試薬（緩衝液1mlあたり5μlのルシフェラーゼはクエンチャー/ シイタケルシフェラーゼ基質）。注：約1ミリリットルの試薬を96ウェルプレート当たりに必要とされる。 </li><li>発光マイクロプレートリーダーを準備します。マイクロプレートリーダーソフトウェアを開きます。システムアイコンの中： <ol><li> 「予熱」タブで、「ON」のチェックボックスをオンにし、25℃に、機械の温度を設定; C. </li><li> 「ディスペンサー」タブの下で、70％エタノール1,000μLとプライム各ディスペンサーは、蒸留水1,000μLが続く。注：各ディスペンサー用アルコールと水の別々のアリコートを使用してください。エタノールはディスペンサーを消毒するために使用され、水が残留エタノールを除去する。 </li><li>プライム空気の1500μlの各ディスペンサー（液体からディスペンサーを削除します）。注意：AIRでのプライミングは、ルシフェラーゼ基質が残留水で希釈されていないことを保証します。 </li><li> （ステップ5.2から）ホタルルシフェラーゼ基質1,080μLと首相ディスペンサー1。 （ステップ5.3から） ウミシイタケルシフェラーゼ基質と首相ディスペンサー2。注：未クロス汚染ルシフェラーゼ基質に注意してください。ルシフェラーゼの基質とプライミング試薬ディスペンサー内のデッドスペースを埋める。 </li></ol></li><li>両方のホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ発光を読むために以下のプロトコルを設定します。マイクロプレートリーダー、国連と関連するソフトウェア内「ファイル」メニューをデア、「新しいタスク」をクリックしてください。 「プロトコル」を強調表示し、「新規作成」をクリックしてください。次のウィンドウで、次の「標準プロトコル」の円を選択する必要があります。 「OK」をクリックします。画面の左側の「手順」をダブルクリックします。 <ol><li>ディスペンサー1を使用して、すべてのウェルにホタルルシフェラーゼ基質を10μlを分注する。「アクション」メニューで、「スペンス」をクリックしてください。 「分注ステップ」ウィンドウで、設定：「ディスペンサー」を1に、誰にも負けない「プライミング」、10μLおよび225μL/秒の「速度」に「ボリュームを分注する」。 「OK」をクリックします。 </li><li> 30秒間、プレートを振る。 「アクション」メニューで、「シェイク」をクリックしてください。 SS： &quot;シェイクステップ」ウィンドウで、中、夜12時30分、MMを「時間」を「強」に設定してください。 「OK」をクリックします。 </li><li>ウェルあたり0.5秒全てのウェルの発光をお読みください。 「アクション」メニューで、「読む」をクリック;。 SS、「フィルタセット」を1に、「発光」：午後12時00分50秒、MMに「検出方法」エンドポイントに発光、「読む種類」、「積分時間」：SS設定ウィンドウ、「ステップをお読みください」の穴に、先頭に「光学位置」、135が「ゲイン」とは、1.00ミリメートルに &quot;高さをお読みください」。 「OK」をクリックします。 </li><li>ディスペンサー2を使用して、すべてのウェルにウミシイタケルシフェラーゼ基質を10μlを分注する。2に設定を除いて、ステップ5.6.1のように「ディスペンサー」の条件を設定します。 </li><li> 30秒間、プレートを振る。ステップ5.6.2のように条件を設定します。 </li><li>ウェルあたり0.5秒全てのウェルの発光をお読みください。ステップ5.6.3のように条件を設定します。 </li></ol></li><li> 96ウェルプレートからふたを外し、マイクロプレートリーダーでプレートを配置します。プレート発光を読むためにステップ5.5で設定したプログラムを起動します。 </li><li>試薬分注ポンプを清掃してください。 「ディスペンサー」タブの下にあるシステムアイコンから： <ol><li> Fの千μLをパージ回収管にホタルルシフェラーゼディスペンサーからireflyルシフェラーゼ基質。 NOTE：ホタルルシフェラーゼは、-80℃で保存して再利用することができる。 </li><li>首相の70％エタノール千μLに続く蒸留水1,000μL、、最終的に空気の1,500μL（液体からディスペンサーをはずして）、各ディスペンサー。注：水が試薬ポンプ、エタノール消毒しからのルシフェラーゼの基質を除去し、空気が残留エタノールを乾燥させる。 </li></ol></li></ol> 6。データ解析<ol><li>データのエクスポート<ol><li>マイクロプレートリーダーソフトウェアでは、画面左側の「レポート/エクスポート·ビルダー」をダブルクリックします。 </li><li>ボタン「Excelへの新たな輸出」をクリックし、「OK」をクリックします。 </li><li> EXPORT1をハイライト表示し、「編集」をクリックします。 <ol><li> 「コンテンツ」の「システムの説明」を確認し、「手順」、「プレートの説明」、および「レイアウトマトリックスプレート」。 「生データ」が含まれるND「データの計算」。 </li><li> 「ワークフロー」の下で、「手続きの完了にする自動実行」を確認してください。エクスポートモードの下では、「新しいワークシートとして &quot;&quot;同じブック内のすべてのプレート &quot;をチェックして。 </li><li> 「ファイル」ファイル名の形式とファイルの場所を選択し、「OK」をクリック下に。 </li><li> 「レポート/エクスポート·ビルダー」ウィンドウを閉じます。 </li></ol></li></ol></li><li>正規化されたルシフェラーゼの値を取得するには、各ウェルのためのウミ発光読み取り（ステップ5.6.6）で各ウェルのためのホタルルシフェラーゼ発光読み取り（ステップ5.6.3）を分割します。 </li></ol>

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S., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+functional+evolution+of+an+odorant+receptor+for+sex-steroid-derived+odors+in+primates.">Dynamic functional evolution of an odorant receptor for sex-steroid-derived odors in primates.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21247-21251 (2009).</li><li>Oka, Y., Nakamura, A., Watanabe, H., Touhara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+odorant+derivative+as+an+antagonist+for+an+olfactory+receptor.">An odorant derivative as an antagonist for an olfactory receptor.</a> Chemical senses. 29 (9), 815-822 (2004).</li><li>Oka, Y., Omura, M., Kataoka, H., Touhara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+receptor+antagonism+between+odorants.">Olfactory receptor antagonism between odorants.</a> The EMBO journal. 23 (1), 120-126 (2004).</li><li>Fawcett, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+ROC+analysis.">An introduction to ROC analysis.</a> Pattern Recognition Letters. 27 (8), 861-874 (2006).</li><li>Baghaei, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+Receptors.">Olfactory Receptors.</a> Olfactory Recept. Methods Protoc. 1003, 229-238 (2013).</li><li>Dey, S., Zhan, S., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+surface+expression+of+chemosensory+receptors+in+heterologous+cells.">Assaying surface expression of chemosensory receptors in heterologous cells.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (48), (2011).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

同一性は、付臭剤の嗅覚受容体活性化パターンによって符号化されるが、受容体は活性化され、どの程度にしているなどの受容体の活性化パターンは、ヒト嗅覚受容体1-11未満の6％のために知られている。嗅覚受容体を特徴づけるための努力は、嗅覚受容体ファミリー17,23,24,33,34のサブセットだけに彼らの労働集約的な方法や適用性によって制限されています。 Hana3A異種発現?...

哺乳類の嗅覚系は、匂い物質の何千もの検出および識別を可能にし、臭気刺激の膨大な数に応答する能力を持っています。嗅覚受容体（ORS）は、嗅上皮12内の嗅細胞によって発現される分子センサーである。哺乳類の匂い認識は匂い物質によるORの差動活性化を介して発生し、または遺伝子ファミリーは、およそ千マウスおよび400ヒト受容体12月16日に、広範囲に及ぶ。嗅覚ニューロンにおける異種細胞でのORの前の機能解析は、さまざまな匂い物質がユニークで認識されていることを示しますが、論理和10,17-20のアンサンブルを重ねてきた。論理和にリガンドを一致させることは嗅覚コードと嗅覚の生のモデルを構築するための不可欠なを理解するために重要です。により、異種システムでの論理和だけでなく、匂い物質と論理和の両方の多数を表現する難しさに、このデータは、Fからのほとんど存在しているield;確かに、人間の論理和未満の6％は、公表リガンド1月11日を持っている。このプロトコルは、付臭剤/ ORの相互作用を特徴づけるルシフェラーゼアッセイの使用が記載されている。このアッセイは、ORのハイスループット特性評価、匂い物質/ ORの相互作用を理解するだけでなく、臭い符号化のモデルを開発するために不可欠であるタスクを可能にします。 ORのハイスループット研究は、三つの主要な課題に直面している。まず、オッズ比は、ERに保持され、その後、プロテアソーム21,22で分解、アッセイ系23〜25内の臭気物質と相互作用するのORを防止し、異種細胞で発現。この問題は、論理和19,26,27の広範囲の安定な細胞表面発現を容易にするアクセサリータンパク質の発見によって対処した。受容体-トランスポータータンパク質1および2（RTP1および2）を促進OR刺激臭剤19に応答して細胞表面発現および活性化。この研究に基づいて、HEK293T細胞であった安定にHana3A細胞株19,27、その結果、長いRTP1（RTP1L）およびRTP2、受容体発現促進タンパク質1、およびGのαolfを発現するように改変された。また、タイプ3ムスカリン性アセチルコリン受容体（M3-R）は、細胞表面での論理和と相互作用し、臭気物質26に反応して活性化を増強する。堅牢でのHana3A細胞の結果にRTP1SとのORとM3-Rの同時トランスフェクション、一貫性があり、細胞表面27でのORの広い範囲の機能的発現。第二に、哺乳類又はレパートリーは非常に大きいです。ヒトでは、例えば、和レパートリーは味覚受容体のレパートリーを超える数々の桁であり、視覚的な受容体のレパートリーを超える数々の2桁。比較的簡単なプロトコルで、単一またはあるのクローンを作成するが、有意なアップフロントの努力は、包括的なライブラリを生成する必要がある。我々は幻の中で、波長は色に変換されることを知っているが、第3、第オーディション周波数がピッチに変換で、臭気の組織はあまりそれが困難な研究者が、臭気物質の代表的なサンプルから補間できるようにすること、理解されている。いくつかの進歩がこのフロント10,28について説明したが、嗅覚風景のマップが不完全なままになります。 ORの数百万の分子に対して、数千の物をスクリーニングすることは困難な作業です。このドメイン内のハイスループットスクリーニングは、慎重に定義のキャンペーンを必要とする。主要な残された課題は、物流とコストではなく、技術に固有の問題点のものです。異種スクリーニングが広く学術基によってリガンドを同定するために使用されていないが、民間企業が100ヒト論理和29に対するリガンドを同定するために同じ技術を使用した。残念ながら、これらのデータは、独自のまま。 ここで概説するハイスループットルシフェラーゼアッセイは、評価OR活性化するために使用される代替方法を超えるいくつかの利点を有する。責任もののネイティブ嗅細胞のSESは電気生理学およびカルシウムイメージングを用いて測定された、これらの技術は、困難なため、嗅覚ニューロンの応答特性の重複にニューロンの応答につながるまたは離れてからかっています。 、GFP標識受容体タイプ30,31にノック32,33嗅覚ニューロンをネズミアデノ経由で特定の受容体を提供するか、17,24,33は単一の受容体の種類に録音をリンクすることができます録音した後、RT-PCRを行うこと、これらの方法ではあるが低スループットと大規模スクリーニングには適していません。異種スクリーニングシステムは、よりスケーラブルであり、2つの主要な形態は、文献で発見されています。cAMP経路の記者やイノシトール三リン酸（IP3）経路の記者。匂い刺激すると、オッズ比は、サイクリックAMP（cAMP）の12の産生をもたらすシグナル伝達カスケードのGαolf伝達を活性化する。交流の制御下にホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を共トランスフェクトすることによりAMP応答エレメント（CRE）、ルシフェラーゼ産生の定量化は、OR活性化を可能にする、匂い応答の関数として測定することができる。または活性化はまた、Gα15/16またはGのα15-OLFキメラ24,25,34などのGタンパク質を共発現によりIP3経路にリンクすることができます。我々は3つの要因に基づいてここで紹介するアッセイを選択している：（1）Rhoのタグを付けた嗅覚受容体とRTP1の共発現は、細胞表面19,27の嗅覚受容体の発現が向上します。 （2）のcAMP応答性レポーター遺伝子の使用は、測定OR標準的なセカンドメッセンジャー経路を介した活性化を可能にする;および（3）アッセイは、ハイスループットスクリーニングに適している。 このハイスループットルシフェラーゼアッセイは、嗅覚の分野に貴重な様々な研究にも適用可能である。まず、論理和をとり、多数の種のための受容体活性化パターンを決定するために、単一臭気物質に対してスクリーニングすることができるecific匂い物質。このタイプの研究は、またはステロイド嗅覚アンドロステ8への対応を担当するようにOR7D4を同定した。逆に、あるORは、受容体応答プロファイル10を決定するために、臭気物質のパネルに対してスクリーニングすることができる。候補嗅覚着臭剤/ OR対は、これらの画面を介して確認された場合、相互作用は、臭気物質の濃度の増加にORの応答を検査する用量反応実験を行うことによって確認することができる。用量応答曲線はまた、進化の種および因果的突然変異を横切る受容体の進化の検査を可能にする、ORの変動は、インビトロ臭剤応答8,9,11,35 に影響し、これらの研究は種間OR変動に拡張することができる方法を評価することができる遺伝36,37は 、最終的に、このアッセイは、既知の着臭剤/受容体対38,39のために拮抗OR特定の臭気物質に応答することができる匂いのアンタゴニストをスクリーニングするために使用することができる。要約すると、これは、高スループットルシフェラーゼアッセイを特徴付ける助けるOR活性化パターン及び嗅覚系における臭気符号化のより良い理解を提供する研究の範囲に適用可能である。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:685px;" width="685">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:135px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:265px;">Hana3A cells</td>
			<td style="width:135px;">Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:265px;">RTP1S-pCI</td>
			<td style="width:135px;">Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:265px;">M3-R-pCI</td>
			<td style="width:135px;">Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">pCRE-luc</td>
			<td style="width:135px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">219076</td>
			<td><a href="http://www.chem.agilent.com/store/ProductDetail.aspx?productID=219076%28Agilent%29">LUC</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">pSV40-RL</td>
			<td style="width:135px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2231</td>
			<td><a href="http://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/prl-renilla-luciferase-control-reporter-vectors/">RL</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Minimum Essential Media, Eagle</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M4655</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m4655?lang=en&amp;region=US">MEM</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000-044</td>
			<td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044?ICID=search-16000044">FBS</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS (without Ca2+ and Mg2+)</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td><a href="http://cellgro.com/products/balanced-salt-solutions/phosphate-buffered-saline/phosphate-buffered-saline-1x-2.html">PBS</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin (0.05% Trypsin EDTA)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300</td>
			<td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054?ICID=search-product">Trypsin</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">CD293</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11913-019</td>
			<td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/11913019?ICID=search-11913019">CD293</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">96 well PDL white/clear plate</td>
			<td style="width:135px;">BD BioCoat</td>
			<td style="width:119px;">356693</td>
			<td><a href="http://www.thomassci.com/Supplies/Tissue-Culture-Cellware/_/BD-Biocoat-Poly-D-Lysine-Culture-Dishes?q=356693">plates</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Lipid transfection reagent: Lipofectamine 2000</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11668-019</td>
			<td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/11668019?ICID=search-11668019">Lipofectamine</a></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:265px;">Firefly luciferase substrate, firefly luciferase quencher/Renilla luciferase substrate: Dual-Glo Assay</td>
			<td style="width:135px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2980</td>
			<td><a href="http://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-assays/dual_glo-luciferase-assay-system/?__utma=1.1932750276.1376486173.1376486173.1376486173.1&amp;__utmb=1.1.10.1376486173&amp;__utmc=1&amp;__utmx=-&amp;__utmz=1.1376486173.1.1.utmcsr=google|utmc">dual glo</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synergy S2&#160;</td>
			<td style="width:135px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">SLAD</td>
			<td><a href="http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy2_multimode_microplate_reader.html">BioTek S2</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Microplate reader software: Gen5 Data Analysis Software</td>
			<td style="width:135px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">Gen5</td>
			<td><a href="http://www.biotek.com/products/microplate_software/gen5_data_analysis_software.html">Gen5</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">BIOSTACK</td>
			<td style="width:135px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">BIOSTACK2WR</td>
			<td><a href="http://www.biotek.com/products/microplate_software/biostack_microplate_stacker.html">BioStack</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Multiflo</td>
			<td style="width:135px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">MFP</td>
			<td><a href="http://www.biotek.com/products/liquid_handling/multiflo_microplate_dispenser.html">MultiFlo</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">300ul GripTips</td>
			<td style="width:135px;">Integra</td>
			<td style="width:119px;">4433</td>
			<td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_4_e.html">GripTips</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">12.5ul GripTips</td>
			<td style="width:135px;">Integra</td>
			<td style="width:119px;">4414</td>
			<td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_4_e.html">GripTips</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">300ul GripTips ViaFlo96</td>
			<td style="width:135px;">Integra</td>
			<td style="width:119px;">6433</td>
			<td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_XYZ_4_e.html">XYZ tips</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">12.5ul GripTips 384 XYZ</td>
			<td style="width:135px;">Integra</td>
			<td style="width:119px;">6403</td>
			<td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_XYZ_4_e.html">XYZ tips</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">384ViaFlo</td>
			<td style="width:135px;">Integra</td>
			<td>6030</td>
			<td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/96_384_channel_pipette.html">384ViaFlo</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TE buffer</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740797.1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d2650?lang=en&amp;region=US">DMSO</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">forskolin</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-CN100-0010</td>
			<td><a href="http://www.thomassci.com/007635F0-AA41-4B24-B46A-05723D685997/_/FORSKOLIN-10MG?q=c002e24">FOR</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput analysis of mammalian olfactory receptors: measurement of receptor activation via luciferase activity

匂い物質は、約千マウスおよび400人の受容体ファミリーは、匂い物質の数千人を認識できるように、嗅覚受容体活性化のユニークで重複パターンを作成します。臭気物質リガンドは、ヒト受容体1から11未満の6％について公表されています。データの欠如は、機能的に異種系でこれらの受容体を発現する困難さに起因する。ここでは、ルシフェラーゼレポーターアッセイを使用して、嗅覚受容体活性化のハイスループット評価に続いHana3A細胞における嗅覚受容体ファミリーの大部分を発現させる方法を記載している。このアッセイは、嗅覚受容体のパネルに対する臭気物質の（1）スクリーンパネルに使用​​することができ; （2）用量反応曲線を経由して匂い物質/受容体相互作用を確認。および（3）受容体変異体のうち、受容体活性化のレベルを比較する。サンプル·データでは、328嗅覚受容体は、臭気物質26に対してスクリーニングした。様々な応答スコアが匂い物質/受容体ペアは選択範囲だったテッドと用量反応でテスト。これらのデータは、画面が用量反応実験に合格する匂い物質/受容体ペアを濃縮するための効果的な方法、匂い物質に対する善意の応答を持っているすなわち受容体であることを示している。したがって、このハイスループットルシフェラーゼアッセイは、哺乳類の嗅覚系における臭気符号化のモデルへ嗅覚受容体に必須な工程を特徴付けるための効果的な方法である。

一次スクリーニングでは、100μMの濃度で26悪臭に対して328 ORをテストしました。この臭気濃度を効果的に既知のリガンド10との論理和の大部分を活性化することが実証されている。まず、正規化されたルシフェラーゼ活性はウミシイタケルシフェラーゼ読み取りによってホタルルシフェラーゼ読み取りを割ることによって計算した。次に、ベースライン値は、各ウェル（ ?...

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High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity

嗅覚受容体活性化パターンは、臭気の同一性をコードするが、哺乳類の嗅覚受容体に対する臭気物質リガンドを同定公表されたデータの欠如は臭気符号化の総合的なモデルの開発を妨げる。このプロトコルは、嗅覚受容体リガンドおよび受容体活性化の定量化のハイスループット同定を容易にする方法が記載されている。

ルシフェラーゼ活性を介し受容体活性化の測定：哺乳類嗅覚受容体のハイスループット分析

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.4K ビュー.  Monell Chemical Senses Center. 嗅覚受容体活性化パターンは、臭気の同一性をコードするが、哺乳類の嗅覚受容体に対する臭気物質リガンドを同定公表されたデータの欠如は臭気符号化の総合的なモデルの開発を妨げる。このプロトコルは、嗅覚受容体リガンドおよび受容体活性化の定量化のハイスループット同定を容易にする方法が記載されている。 

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Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the anterior hypothalamus. The clock is directly synchronized by light via the retina and optic nerve. Circadian oscillations are generated by interacting negative feedback loops of a number of so called "clock genes" and their protein products, including the Period (Per) genes. The core clock is also dependent on membrane depolarization, calcium and cAMP 1. The SCN shows daily oscillations in clock gene expression, metabolic activity and spontaneous electrical activity. Remarkably, this endogenous cyclic activity persists in adult tissue slices of the SCN 2-4. In this way, the biological clock can easily be studied in vitro, allowing molecular, electrophysiological and metabolic investigations of the pacemaker function.
The SCN is a small, well-defined bilateral structure located right above the optic chiasm 5. In the rat it contains ~8.000 neurons in each nucleus and has dimensions of approximately 947 &mu;m (length, rostrocaudal axis) x 424 &mu;m (width) x 390 &mu;m (height) 6. To dissect out the SCN it is necessary to cut a brain slice at the specific level of the brain where the SCN can be identified. Here, we describe the dissecting and slicing procedure of the SCN, which is similar for mouse and rat brains. Further, we show how to culture the dissected tissue organotypically on a membrane 7, a technique developed for SCN tissue culture by Yamazaki et al. 8. Finally, we demonstrate how transgenic tissue can be used for measuring expression of clock genes/proteins using dynamic luciferase reporter technology, a method that originally was used for circadian measurements by Geusz et al. 9. We here use SCN tissues from the transgenic knock-in PERIOD2::LUCIFERASE mice produced by Yoo et al. 10. The mice contain a fusion protein of PERIOD (PER) 2 and the firefly enzyme LUCIFERASE. When PER2 is translated in the presence of the substrate for luciferase, i.e. luciferin, the PER2 expression can be monitored as bioluminescence when luciferase catalyzes the oxidation of luciferin. The number of emitted photons positively correlates to the amount of produced PER2 protein, and the bioluminescence rhythms match the PER2 protein rhythm in vivo 10. In this way the cyclic variation in PER2 expression can be continuously monitored real time during many days. The protocol we follow for tissue culturing and real-time bioluminescence recording has been thoroughly described by Yamazaki and Takahashi 11.

The procedure of preparing slices containing the adult mouse hypothalamic suprachiasmatic nucleus (SCN), and a rapid way to culture the SCN tissue in organotypic culture condition, are reported. Further, the measurement of oscillatory clock gene protein expression using dynamic luciferase reporter technology is described.

スライスの準備、器官組織培養と視交叉上核における時計遺伝子の活動のルシフェラーゼ記録

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

神経科学

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

開発マウス網膜の in vivoエレクトロポレーションで

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex behaviors such as food choice, predator, conspecific and mate recognition and other socially relevant cues. Olfactory receptor neurons (ORNs) are located in the dorsal part of the nasal cavity embedded in the olfactory epithelium. These bipolar neurons send an axon to the olfactory bulb (see Fig. 1, Reisert &amp; Zhao1, originally published in the Journal of General Physiology) and extend a single dendrite to the epithelial border from where cilia radiate into the mucus that covers the olfactory epithelium. The cilia contain the signal transduction machinery that ultimately leads to excitatory current influx through the ciliary transduction channels, a cyclic nucleotide-gated (CNG) channel and a Ca2+-activated Cl- channel (Fig. 1). The ensuing depolarization triggers action potential generation at the cell body2-4.
In this video we describe the use of the "suction pipette technique" to record odorant-induced responses from ORNs. This method was originally developed to record from rod photoreceptors5 and a variant of this method can be found at jove.com modified to record from mouse cone photoreceptors6. The suction pipette technique was later adapted to also record from ORNs7,8. Briefly, following dissociation of the olfactory epithelium and cell isolation, the entire cell body of an ORN is sucked into the tip of a recording pipette. The dendrite and the cilia remain exposed to the bath solution and thus accessible to solution changes to enable e.g. odorant or pharmacological blocker application. In this configuration, no access to the intracellular environment is gained (no whole-cell voltage clamp) and the intracellular voltage remains free to vary. This allows the simultaneous recording of the slow receptor current that originates at the cilia and fast action potentials fired by the cell body9. The difference in kinetics between these two signals allows them to be separated using different filter settings. This technique can be used on any wild type or knockout mouse or to record selectively from ORNs that also express GFP to label specific subsets of ORNs, e.g. expressing a given odorant receptor or ion channel.

Olfactory receptor neurons (ORNs) convert odor signals first into a receptor current that in turn triggers action potentials that are conveyed to second order neurons in the olfactory bulb. Here we describe the suction pipette technique to record simultaneously the odorant-induced receptor current and action potentials from mouse ORNs.

吸引ピペット技術を用いた嗅覚受容ニューロンから記録匂い物質誘発性応答

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system measures spontaneous behaviors and the response to an aversive stimulus, which is shown to the larvae via a PowerPoint presentation. The recorded images are analyzed with an ImageJ macro, which automatically splits the color channels, subtracts the background, and applies a threshold to identify individual larvae placement in the lanes. We can then import the coordinates into an Excel sheet to quantify swim speed, preference for edge or side of the lane, resting behavior, thigmotaxis, distance between larvae, and avoidance behavior. Subtle changes in behavior are easily detected using our system, making it useful for behavioral analyses after exposure to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Our laboratory developed a novel high-throughput automated imaging system that is useful for the detection of several different behaviors in 7-day-old zebrafish larvae. The system can be used for detecting subtle changes in behavior after the larvae have been exposed to environmental toxicants or pharmaceuticals.

ゼブラフィッシュ幼生における自動化ハイスループット行動分析

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral delivery or transgenic animals have potential confounds that make interpretation of results from these studies difficult. New radiological tools are emerging, however, that allow one to noninvasively investigate the function of select groups of adult-born neurons through accurate and precise anatomical targeting in small animals. Focal ionizing radiation inhibits the birth and differentiation of new neurons, and allows targeting of specific neural progenitor regions. In order to illuminate the potential functional role that adult hypothalamic neurogenesis plays in the regulation of physiological processes, we developed a noninvasive focal irradiation technique to selectively inhibit the birth of adult-born neurons in the hypothalamic median eminence. We describe a method for Computer tomography-guided focal irradiation (CFIR) delivery to enable precise and accurate anatomical targeting in small animals. CFIR uses three-dimensional volumetric image guidance for localization and targeting of the radiation dose, minimizes radiation exposure to nontargeted brain regions, and allows for conformal dose distribution with sharp beam boundaries. This protocol allows one to ask questions regarding the function of adult-born neurons, but also opens areas to questions in areas of radiobiology, tumor biology, and immunology. These radiological tools will facilitate the translation of discoveries at the bench to the bedside.

The function of adult-born mammalian neurons remains an active area of investigation. Ionizing radiation inhibits the birth of new neurons. Using computer tomography-guided focal irradiation (CFIR), three-dimensional anatomical targeting of specific neural progenitor populations can now be used to assess the functional role of adult neurogenesis.

焦点放射線阻害と大人の視床下部ニューロン新生の機能的な尋問

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

における嗅覚受容ニューロンのホールマウント免疫標識<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;アンテナ

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

FIM Imaging and FIMtrack: Two New Tools Allowing High-throughput and Cost Effective Locomotion Analysis

The analysis of neuronal network function requires a reliable measurement of behavioral traits. Since the behavior of freely moving animals is variable to a certain degree, many animals have to be analyzed, to obtain statistically significant data. This in turn requires a computer assisted automated quantification of locomotion patterns. To obtain high contrast images of almost translucent and small moving objects, a novel imaging technique based on frustrated total internal reflection called FIM was developed. In this setup, animals are only illuminated with infrared light at the very specific position of contact with the underlying crawling surface. This methodology results in very high contrast images. Subsequently, these high contrast images are processed using established contour tracking algorithms. Based on this, we developed the FIMTrack software, which serves to extract a number of features needed to quantitatively describe a large variety of locomotion characteristics. During the development of this software package, we focused our efforts on an open source architecture allowing the easy addition of further modules. The program operates platform independent and is accompanied by an intuitive GUI guiding the user through data analysis. All locomotion parameter values are given in form of csv files allowing further data analyses. In addition, a Results Viewer integrated into the tracking software provides the opportunity to interactively review and adjust the output, as might be needed during stimulus integration. The power of FIM and FIMTrack is demonstrated by studying the locomotion of Drosophila larvae.

FIM is a novel, cost effective imaging system designed to track small moving objects such as C. elegans, planaria or Drosophila larvae. The accompanying FIMTrack program is designed to deliver fast and efficient data analysis. Together, these tools allow high-throughput analysis of behavioral traits.

FIMイメージングとFIMtrack：高スループットとコスト効果的な歩行分析を可能に二つの新しいツール

The analysis of neuronal network function requires a reliable measurement of behavioral traits. Since the behavior of freely moving animals is variable to ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

無傷の神経上皮におけるマウス嗅細胞の穿孔パッチクランプ記録：同定された嗅覚受容体を発現するニューロンの機能解析

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

網膜リボンシナプスにおける膜受容体の高分解能定量的イムノゴールド分析

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Receptor Autoradiography Protocol for the Localized Visualization of Angiotensin II Receptors

This protocol describes receptor binding patterns for Angiotensin II (Ang II) in the rat brain using a radioligand specific for Ang II receptors to perform receptor autoradiographic mapping.
Tissue specimens are harvested and stored at -80 &#176;C. A cryostat is used to coronally section the tissue (brain) and thaw-mount the sections onto charged slides. The slide-mounted tissue sections are incubated in 125I-SI-Ang II to radiolabel Ang II receptors. Adjacent slides are separated into two sets: &#39;non-specific binding&#39; (NSP) in the presence of a receptor saturating concentration of non-radiolabeled Ang II, or an AT1 Ang II receptor subtype (AT1R) selective Ang II receptor antagonist, and &#39;total binding&#39; with no AT1R antagonist. A saturating concentration of AT2 Ang II receptor subtype (AT2R) antagonist (PD123319, 10 &#181;M) is also present in the incubation buffer to limit 125I-SI-Ang II binding to the AT1R subtype. During a 30 min pre-incubation at ~22 &#176;C, NSP slides are exposed to 10 &#181;M PD123319 and losartan, while &#39;total binding&#39; slides are exposed to 10 &#181;M PD123319. Slides are then incubated with 125I-SI-Ang II in the presence of PD123319 for &#39;total binding&#39;, and PD123319 and losartan for NSP in assay buffer, followed by several &#39;washes&#39; in buffer, and water to remove salt and non-specifically bound radioligand. The slides are dried using blow-dryers, then exposed to autoradiography film using a specialized film and cassette. The film is developed and the images are scanned into a computer for visual and quantitative densitometry using a proprietary imaging system and a spreadsheet. An additional set of slides are thionin-stained for histological comparisons.
The advantage of using receptor autoradiography is the ability to visualize Ang II receptors in situ, within a section of a tissue specimen, and anatomically identify the region of the tissue by comparing it to an adjacent histological reference section.

Here we present a protocol to describe the localization of angiotensin II Type 1 receptors in the rat brain by quantitative, densitometric, in vitro receptor autoradiography using an iodine-125 labeled analog of angiotensin II.

アンジオテンシンII受容体のローカライズされた可視化のための受容体オートラジオグラフィープロトコル

This protocol describes receptor binding patterns for Angiotensin II (Ang II) in the rat brain using a radioligand specific for Ang II receptors to ...