Mi laboratorio ha estado estudiando el papel de la vía Hipo Hippo en el cáncer de mama y pulmón, y recientemente, hemos desarrollado un nuevo biosensor para monitorear la actividad de señalización de Hippo. Este método se puede utilizar para responder preguntas clave sobre las redes de señalización celular, como cómo la vía Hippo responde a los factores y cómo interactúa con otras vías de señalización. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes es su gran sensibilidad y también el gran número de muestras se pueden procesar de forma rápida y simultánea.
Esta técnica tiene diversas aplicaciones en la investigación básica y traslacional para investigar los reguladores de la vía de señalización Hippo tanto in vitro como in vivo. Para empezar, mini-preparación plásmidos LATS-BS frescos del cultivo líquido de bacterias DH5-Alpha. Una hora antes de la transfección, aspirar el medio de la placa, y añadir 500 microlitros de medio de crecimiento a cada pocero.
Un punto importante es que el biosensor LATS debe estar preparado fresco para obtener la máxima expresión y actividad. Además, se recomienda utilizar siempre un regulador aguas arriba de la vía hipopótamo, como MSD, como un control positivo al realizar el ensayo de luciferasa. Después de esto, devuelva las células a la incubadora.
A continuación, prepare la solución A, una solución de ADN, y la solución B, un reactivo de transfección diluido a base de polímeros, como se describe en el protocolo de texto. Después de esto, agregue inmediatamente la solución B a la solución A, y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Incubar la muestra a temperatura ambiente durante 15 minutos para permitir la formación de los complejos de transfección.
A continuación, agregue el volumen total de complejos de transfección gota a cada pocero de la placa con suave remolino. Incubar las células durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente, retire los medios complejos que contienen la transfección y sustitúyalo por medios completos y frescos.
Luego cultiva las células a 37 grados centígrados por un día más. Diluir una cantidad adecuada de 5x tampón de lisis pasiva con agua destilada. Entonces, aspira completamente el medio de la placa.
Agregue un mililitro de PBS a cada pozo, y gire suavemente la placa para eliminar las células separadas y los medios de crecimiento residual. A continuación, aspirar el PBS por completo. A continuación, agregue 250 microlitros de 1xPLB a cada pozo.
Coloque la placa de cultivo en una plataforma de balanceo durante 15 minutos para garantizar una cobertura uniforme de la monocapa celular con PLB. Después de esto, transfiera el izado a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Retire el LAR-2 de un almacenamiento de 80 grados Centígrados y equilibrelo a temperatura ambiente.
A continuación, prepare el reactivo de detección de renilla para una cantidad adecuada de ensayos. Agregue el reactivo de detección Renilla al sustrato 50x y su tampón. A continuación, dispensar 10 microlitros de cada célula de litote en tubos de 1,5 mililitros.
A continuación, programe un luminómetro para realizar un retardo de pre-medida de dos segundos, seguido de un período de medición de 10 segundos. Transfiera con cuidado 20 microlitros de reactivo LAR-2 a un tubo, y pipetee rápidamente hacia arriba y hacia abajo para mezclar. A continuación, coloque inmediatamente el tubo en el luminómetro e inicie la lectura.
Después de la lectura, retire el tubo de muestra del luminómetro, agregue 20 microlitros de reactivo Renilla y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar. A continuación, coloque la muestra en el luminómetro e inicie la siguiente lectura. En primer lugar, la referencia cultural, la separación, el recuento y la placa HEK293 Ad-cells como se describe en el protocolo de texto.
Luego, una hora antes de la transfección, aspirar el medio de la placa y reemplazarlo con cinco mililitros de medios de crecimiento completos frescos. Por último, agregue la solución diluida B a la solución A, y la pipeta hacia arriba y hacia abajo para mezclar. A continuación, incubar la muestra a temperatura ambiente durante 15 minutos antes de añadir el volumen total de los complejos de transfección a la placa, mientras se arremolina suavemente.
Incubar las células durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente, tripsize y cuente las células. Placa 10.000 a 20.000 células en cada pozo de una placa de 96 pozos en un volumen total de 100 microlitros de medios por pozo.
Después de esto, incubar las células por un día más. De una a cuatro horas antes de realizar el ensayo de luciferasa, añadir agentes que regulan potencialmente la vía del hipopótamo, a una concentración final de 10 micromolares por pozo. A continuación, aspirar los medios completamente de las células y lavar las células en cada pozo con 100 microlitros de PBS.
A continuación, agregue 20 microlitros de PLB a cada pozo. Coloque la placa de cultivo en una plataforma de balanceo durante 15 minutos. A continuación, transfiera 20 microlitros de reactivo LAR-2 a cada pozo de la placa, y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar.
Inmediatamente después de esto, coloque la placa en un luminómetro de lectura de placas e inicie la lectura. En la primera parte de este protocolo, el LATS-BS fue cotrans infectado con diferentes genes para evaluar su efecto sobre la actividad quinasa de LATS. En el segundo protocolo, LATS-BS fue trans infectado en HEK293-Ad, y las células fueron pasadas a placas de 96 pozos.
40 horas después de la transfección, las células fueron tratadas con diferentes reguladores de moléculas pequeñas conocidos de señalización Hippo, seguido de un ensayo de luciferasa. Al interpretar los resultados de estos ensayos, cabe señalar que las proteínas y los tratamientos farmacológicos pueden activar las vías de retroalimentación que influyen en la actividad de los biosensores. Se necesitarán más experimentos para confirmar una relación entre el candidato y la vía de señalización de Hippo.
Siguiendo este procedimiento, otros métodos como la PCR cuantitativa en tiempo real, o Western Blot, se pueden utilizar para responder preguntas adicionales sobre la actividad quinasa de LATS. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología del cáncer exploraran la dinámica y la actividad de la quinasa LATS y la vía de señalización de Hippo en muchos procesos biológicos y bioquímicos. No olvide que los medicamentos para el cribado pueden ser extremadamente peligrosos, y siempre se deben tomar las precauciones adecuadas al realizar este procedimiento.
