私たちのプロトコルは、遺伝子回路ベースの診断の設計、組み立て、および検証について説明しています。これらの紙ベースの分子診断は、低コストで高感度であり、臨床的に関連する濃度の核酸を検出でき、事実上あらゆる配列を検出するように設計できます。これは、ユーザーがニーズに合わせて設計できるプラットフォームテクノロジーであり、臨床グレードの診断をより分散型の歯科リソース設定に持ち込む可能性があります。
セルフリートーホールドスイッチセンサーは、ほぼすべての核酸ベースのターゲット用に設計できます。最近の研究では、エボラ出血熱、ノロウイルス、SARS-CoV-2、C.ディフィシル、腸チフスの原因となる細菌の無細胞診断が実証されています。手順を実演するのは、ポスドクのセヴェリーノ・ジェファーソン・リベロ・ダ・シルバと、私の研究室の博士課程の学生であるプーリヤ・バヤットです。
トーホールドスイッチを設計するには、テキストプロトコルに記載されているように、ジカウイルスゲノムからターゲット配列を特定し、アンプリコンからジカウイルスターゲット配列を選択します。トーホールドスイッチ設計ソフトウェアパッケージをダウンロードします。MATLABを開き、設計ソフトウェアフォルダに移動します。
入力サブフォルダーにあるデザイン入力ファイルのcsvファイルにターゲットシーケンスを入力します。設計関数に使用するパラメータを選択します。計画関数を実行して、対象のターゲットのトーホールドスイッチ計画を生成します。
完了したら、final_designsフォルダーに移動し、csv形式のスプレッドシートでトップトーホールドスイッチデザインシーケンスと対応するターゲットシーケンスを見つけます。アルゴリズムによって生成されたトーホールドスイッチDNA配列に、5つのプライム末端にT7プロモーター配列が含まれ、3つのプライム末端に保存された21ヌクレオチドリンカー配列が含まれていることを確認します。NCBI BLASTを使用して、配列の相同性をチェックすることにより、トップトーホールドスイッチの設計シーケンスを他の一般的なウイルスに対してスクリーニングします。
ヘモロジーが40%未満の配列を受け入れます。トーホールドスイッチヘアピンDNAオリゴと逆増幅プライマーの溶液をヌクレアーゼフリー水中で10マイクロモルの濃度で調製します。この表に従って、氷上のPCRチューブで反応を組み立てます。
この表にリストされているサイクリング条件に従って、反応チューブをサーモサイクラーに入れます。アガロースゲルでPCR産物を分析します。PCR産物を精製し、最小限の量のヌクレアーゼフリー水でDNAを溶出して、十分に高い濃度を確保します。
分光光度計を使用してDNAを定量します。25ミリグラムの粉末を1ミリリットルのヌクレアーゼフリー水に溶解してCPRGストック溶液を調製します。ここに示す標準プロトコルに従って、氷上でマスターミックスを準備します。
無細胞マスターミックスをPCRチューブに分注します。セルフリーコントロールおよびスイッチアローンコントロールの場合は、ヌクレアーゼフリーの水を5.94マイクロリットルの容量まで追加します。また、反応のために、PCR精製されたトーホールドスイッチDNAを追加して、33ナノモルの最終濃度を取得します。
トーホールドスイッチとターゲットRNAの組み合わせをテストするには、in vitroで転写されたターゲットRNAを最終濃度1マイクロモルまで追加します。ピペッティングと遠心分離機ですべての反応を完全に混合します。黒く透明な底の384ウェルプレートで、反応ウェルの周囲のウェルに30マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を追加します。
次に、2ミリメートルの生検パンチとピンセットを使用して、BSAブロックされたろ紙ディスクを切断し、反応ウェルに入れます。各反応チューブから384ウェルプレートのろ紙ディスクに1.8マイクロリットルを384ウェルプレートで分注します。プレートを透明なPCRフィルムで覆い、プレートリーダーに入れます。
摂氏37度で570ナノメートルの吸光度を毎分130分間測定します。すべてのフォワードプライマーセットとリバースプライマーセットの25マイクロモルストック溶液をヌクレアーゼフリー水中で調製します。ここに示すマスターミックスを使用して5マイクロリットルの反応を設定します。
白色沈殿物が可溶になるまでピペッティングで混合し、PCRチューブに分注します。フォワードプライマーとリバースプライマーを適切なチューブに加え、続いて1マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水または2ピコモルのターゲットトリガーRNAを加えます。穏やかなピペッティングで混合し、チューブを短時間回転させます。
ここに示すように、サーモサイクラーでインキュベーションプロトコルを設定します。12分後、チューブを取り外し、各チューブに1.25マイクロリットルの酵素ミックスを加え、続いて混合と遠心分離を行います。摂氏41度のホールドステップをスキップした後、チューブをサーモサイクラーに戻し、1時間の反応インキュベーションを開始します。
次に、プライマーの性能を評価するために、紙ベースのセルフリートーホールドスイッチ反応を組み立て、データを分析します。感度解析では、候補プライマーペアを特定し、ヌクレアーゼフリー水中でターゲット RNA の段階希釈液を調製します。NASBAおよび無細胞反応を、生物学的トリプリケート中の選択されたプライマーセットで繰り返します。
抽出した患者RNA1マイクロリットルを用いて、セクション5に示すようにNASBA増幅および紙ベースの無細胞反応を行う。反応後、384ウェル反応プレートを準備し、ポータブルプレートリーダーで37°Cでアッセイを実行します。次に、RT-qPCRコンポーネントを組み立て、この表に従って1.5ミリリットルの微量遠心チューブに試薬を追加します。
ピペッティングで反応を混合します。96ウェルまたは384ウェルPCRプレートの各ウェルに6.5マイクロリットルを分注し、続いて各RNAテンプレートを3.5マイクロリットルずつ3.5マイクロリットルずつ分注します。プレートの上部にPCRフィルムを置きます。
384ウェルプレートを600倍Gで2分間遠心分離します。プレートをRT-qPCRマシンに入れ、ここに示すようにサイクリング条件を実行します。計算設計に続いて、3つのトーホールドスイッチを構築し、アガロースゲル電気泳動を使用して分析しました。
約3, 000塩基対のバンドが反応の成功を示した。トーホールドスイッチは、それぞれのin vitro転写トリガーRNAに対して評価されました。3つのセンサーはすべて吸光度の増加を示したが、センサ27Bは最も速いオンレートを示したが、スイッチ33Bおよび47Bはバックグラウンド活性を示す低いオン/オフ比を有し、特異度が低下した。
570ナノメートルでの吸光度の倍率変化は、スイッチ27Bがオン/オフ信号比で最高の性能を有することを示した。さらに、NASBAと組み合わせると、マイクロリットルあたり124分子という低い濃度のRNAを検出でき、高感度です。ブラジルからのジカウイルス患者サンプルは、ポータブルプレートリーダーを使用してセンサーの臨床診断精度を評価するためにテストされました。
黄色から紫への色の変化は、陽性サンプルを特定しました。各紙ベースの反応の比色応答は、PLUMポータブルプレートリーダー上の統合ソフトウェアによって経時的にプロットされました。閾値を超えたサンプルは陽性とみなされた。
センサーの臨床性能は、RT-qPCRとの比較によって確立されました。サンプルは、サイクルしきい値が38以下の場合に陽性と見なされました。患者の試験を進める前に、トーホールドスイッチスクリーンとNASBAプライマー感度の結果が再現性があり、最適化されていることを確認することが重要です。
そのシンプルさと適応性を考えると、ここで説明する診断プラットフォームは、特に低所得国にとって、医療システムに利益をもたらすことができる新しいポイントオブケアツールの開発への道を開きました。
