この方法は、細菌、血液細胞、筋肉を裏打ちする内皮細胞間の相互作用などの分野を通じて、感染性心内膜炎の病因の主要な質問に答えることができます。この技術の主な利点は、組織移植片が標準化された流れの条件で細菌、血小板、タンパク質などの様々な標的との相互相互作用に直接さらされる可能性があることです。この技術の意味は、重要な分子相互作用と特定の組織の高い感染性を促進する要因を解明することができるので、感染性心内膜炎の治療にも及ぶ。
この方法は、植生形成の病因に関する洞察を提供する。血管透過性、細胞移動性、遺伝子細胞発現を調査する研究にも応用可能です。プロトコルを開始するには、以前に調製した組織生検を直径10ミリメートル、顕微鏡スライドと8ミリメートルの円形穿孔の間に同じ厚さと、内面を上に向けたゴム製ガスケットを置き、細菌懸濁液に接触させる。
ホルダーに入れたまま組織移植の向きに焦点を合わせます。組織の内面が既に血流面に露出していることを確認し、実験媒体に接触するようにしてください。次に、チャンバーの下部の金属フレームに埋め込まれているガスケットシートに組織を持つホルダーを挿入します。
上部の金属フレームと対応するガスケットシートを、以前に挿入した組織ホルダーを使用してチャンバの底部に取り付けます。その後、8本のネジとネジナットでチャンバー全体を取り付けます。キャリパーまたは定規を使用して、チャンバーの高さが常に移植片全体で同じであることを確認します。
次に、流れチャンバを蠕動ポンプで接続します。その後、チューブで400ミリリットルの流体貯留層を接続します。蠕動ポンプと細菌貯留層を使用して1時間あたり3回の食事と毎分4ミリリットルの対応する流量の完全なストレスを持つリン酸緩衝生理食塩水の7つの蛍光標識コロニー形成ユニットに100ミリリットルの懸濁液を100ミリリットルの組織を浸透させます。
同じ回収槽を使用して100ミリリットルの細菌懸濁液を連続的に再循環させる。灌流後、チャンバーを解体して移植片を放出する。軌道シェーカーを使用して12ウェルプレートで4ミリリットルのPBSで組織片を2回洗浄します。
次に、より小さい直径の皮膚生検パンチを使用して移植片の内側部分を切断する。各組織生検を、1ミリリットルの無菌0.9%塩化ナトリウムを含む別々の14ミリリットルチューブに入れる。10分間超音波処理浴を使用して組織から細菌を取り外します。
10ミリリットルの無菌0.9%塩化ナトリウムを用いた単一の14ミリリットルチューブを準備し、超音波処理後に得られた細菌懸濁液の連続希釈液を作ります。チューブ番号 2 にラベルを付けます。10ミリリットルの無菌0.9%塩化ナトリウムを用いて、14ミリリットルのチューブを3本用意し、最初の細菌懸濁液を実験に取り込んだ。
チューブ番号3、4番、5番にラベルを付けます。次に、3枚の寒天プレートを確保し、1つは細菌灌流用、1つはPBSの制御灌流用、3つ目は灌流に使用される初期細菌懸濁液用に備える。次の方法で組織実験のためのプレートあたり3つのセクターにラベルを付けます:10-1、10-3、および10-4。
細菌の浸透中のコロニー形成単位の数を数えるために、次のようにプレートにラベルを付ける:10-1、10-3、10-5、および10-7。各15秒間、組織生検を含むチューブをボルテックスし、連続希釈液を作る。シリアル希釈液を調製するには、チューブ番号1の100マイクロリットルをチューブナンバー2に移し、チューブをボルテックスして溶液を完全に混合します。
チューブ番号1とナンバー2の内容物の100マイクロリットルを、寒天板の10-1と10-3の対応するセクターに広げます。その後、セクター10 4にチューブナンバー2の10マイクロリットルを広げます。このステップを4回繰り返して、10マイクロリットルの各体積から4つの別々の成長を得る。
初期培養の連続希釈を調製するために、まず15秒間希釈し、100マイクロリットルの細菌懸濁液をチューブ3に移し、渦によって激しく混合した。チューブ番号4にチューブ番号3の100マイクロリットルを追加し、再び混合します。チューブ番号4からチューブ番号5の手順を繰り返します。
チューブ番号3、ナンバー4、5、および標識された初期培養物の内容物の100マイクロリットルを、それぞれ血液寒天板の10-3、10-5、10-7、および10-1のセクターに広げる。薄層フードの下に血液寒天プレートを残して、細菌の広がりを空気乾燥させ、通常は10分間乾燥させる。その後、プレートを摂氏37度に置き、一晩のインキュベーションを行います。
一晩インキュベーションした後、細菌コロニーを数えてCFUsの数を得る。全くのストレス状態下では、ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌感染の両方について、様々な移植片組織にわたる同様の細菌付着が観察された。手順に従って、レンサ球菌サンギニスは、牛の心膜パッチと比較した場合、牛頸静脈壁への付着の有意な減少を示した。
3種の細菌を比較すると、サングイニスは、ブドウ球菌およびブドウ球菌表皮症に関連して、牛頸静脈壁への接着性が有意に低い。この手順を試みる間、同じ頭部の正しい組織を準備することを忘れないでください。すべての実験標本で同様の条件を保証し、異なる一連の実験間のデータ変動を最小限に抑えます。
その開発後、この技術は、研究者が医学的地位に近い完全な複雑さを構築するために、異なる要素を持つ彼らのインビトロモデルアプローチを豊かにすることによって、段階的に複雑な障害システムを探求することを可能にします。
