Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в патогенеза инфекционного эндокардита, и патобиограммы через такие поля, как взаимодействие между бактериями, кровяными клетками и эндотелиальными клетками, выстилающими мускулатуру. Основным преимуществом этого метода является то, что трансплантаты тканей могут быть непосредственно подвержены взаимному взаимодействию с различными целями, такими как бактерии, тромбоциты и белки в стандартизированных условиях потока. Последствия этого метода распространяются на нашу терапию инфекционного эндокардита, потому что он может распутать важные молекулярные взаимодействия и факторы, способствующие высокой инфекционности некоторых тканей.
Этот метод дает представление о патогенеза формирования растительности. Он также может быть применим в исследованиях, исследуя проницаемость сосудов, подвижность клеток и экспрессию генных клеток. Для начала протокола поместите предварительно подготовленную биопсию тканей диаметром 10 миллиметров, а также ту же толщину между слайдом микроскопа и восьмимиллиметровой круговой перфорацией, а также резиновую прокладку с внутренней поверхностью вверх, чтобы связаться с бактериальной суспензией.
Сосредоточьтесь на ориентации трансплантата тканей при размещении в держателе. Убедитесь, что внутренняя поверхность ткани уже подвергается воздействию кровотока лица до контакта с экспериментальной среде. Затем вставьте держатель с тканью в лист прокладки, который встроен в нижний металлический каркас камеры.
Прикрепите верхнюю металлическую раму с соответствующим листом прокладки на дно камеры с ранее вставленным держателем ткани. Затем смонтировать всю камеру с восемью винтами и винт орехи. Убедитесь, что высота камеры всегда одинакова в трансплантатах с помощью калипера или линейки.
Затем соедините камеру потока с перистальным насосом. Затем соедините резервуар жидкости 400 миллилитров с трубками. Perfuse тканей со 100 миллилитров подвески от десяти до семи флуоресцентно помечены колонии формирования единиц в фосфатных буферных солевой раствор с отвесным стрессом от трех дина на квадратный сантиметр и соответствующая скорость потока четыре миллилитров в минуту в течение одного часа с помощью перисталистического насоса и бактериального резервуара.
Непрерывно рециркуляция 100-миллилитровой бактериальной суспензии с использованием одного и того же резервуара для сбора. После перфузии, демонтировать камеру, чтобы освободить трансплантата. Вымойте часть ткани два раза с четырьмя миллилитров PBS в 12-хорошо пластины с помощью орбитального шейкера в течение трех минут.
Затем вырезать внутреннюю часть трансплантата с помощью биопсии кожи удар с меньшим диаметром. Поместите биопсию каждой ткани в отдельную 14-миллилитровую трубку, содержащую один миллилитр стерильного хлорида натрия 0,9%. Отсоедините бактерии от ткани с помощью звуковой ванны в течение 10 минут.
Приготовьте одну 14 миллилитровую трубку с 10 миллилитров стерильного 0,9% хлорида натрия, чтобы сделать серийные разбавления бактериальной суспензии, полученной после звукового одеяния. Наклеить ярлык на трубку номер два. Подготовка трех 14 миллилитров трубки с 10 миллилитров стерильных 0,9% хлорида натрия для серийных разбавления первоначальной бактериальной суспензии, принятых в эксперимент изобилия.
Этикетка труб номер три, номер четыре и номер пять. Затем закресите три агарные пластины, одну для бактериальной перфузии, одну для контрольной перфузии PBS, и третью для первоначальной бактериальной суспензии, используемой для перфузии. Этикетка три сектора на тарелку для эксперимента ткани следующим образом:10-1, 10-3 и 10-4.
Чтобы подсчитать количество колонийообразующих единиц в бактериальной перфузии, обозначить пластину следующим образом: 10-1, 10-3, 10-5 и 10-7. Vortex трубки, содержащие биопсии тканей в течение 15 секунд каждый, чтобы сделать серийные разбавления. Чтобы подготовить серийные разбавления, перенесите 100 микролитров трубки номер один в трубку номер два, и вихрь трубки тщательно перемешать раствор.
Распространение 100 микролитров содержимого трубки номер один и номер два на соответствующие сектора, 10-1 и 10-3 агар пластины. Затем распространение 10 микролитров трубки номер два на секторе 10 четыре. Повторите этот шаг четыре раза, чтобы получить четыре отдельных на роста от каждого объема 10 микролитров.
Чтобы подготовить серийные разбавления начальной культуры, сначала вихрь разбавления в течение 15 секунд и передачи 100 микролитров бактериальной суспензии в трубку номер три, и энергично смешивать вихрем. Добавьте 100 микролитров трубки номер три в трубку номер четыре и снова перемешайте. Повторите процедуру трубки номер пять из трубки номер четыре.
Распространение 100 микролитров содержимого трубок номер три, номер четыре, номер пять, и помечены начальной культуры соответственно на секторах 10-3, 10-5, 10-7 и 10-1 крови агар пластины. Оставьте пластины агара крови под ламинарным капюшоном, чтобы высушить бактериальные спреды, как правило, в течение 10 минут. После этого поместите пластины при 37 градусах по Цельсию для ночной инкубации.
После ночной инкубации, подсчитайте бактериальные колонии, чтобы получить количество CFUs. В условиях стресса, аналогичные бактериальные привязанности через различные ткани трансплантата наблюдалось как для золотистого стафилококка и стафилококка эпидермидис инфекции. После процедур, стрептококк сангвинис отображается значительное снижение приверженности к бычьей яремной стенки вены, по сравнению с крупного рогатого скота перикард патч.
При сравнении трех видов бактерий, стрептококк сангвинис представляет значительно более низкую адгезию стенки яремной вены крупного рогатого скота по отношению к золотистым стафилококку и стафилококку эпидермидиса. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы подготовить правильные ткани одной и той же головы. Это обеспечит аналогичные условия во всех образцах экспериментов и сведет к минимуму изменчивость данных между различными сериями экспериментов.
После своего развития, этот метод позволяет исследователям исследовать сложные системы разлада в step by step manner путем обогащать их подходы модели in vitro с по-разному элементами для того чтобы build up полная сложность close to медицинское состояние.
