Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella patogenesi dell'endocardite infettiva e dei pathobiogrammi attraverso campi come l'interazione tra batteri, cellule del sangue e cellule endoteliali che rivestono muscolatura. Il principale vantaggio di questa tecnica è che gli innesti tissutali potrebbero essere direttamente esposti a interazioni reciproche con vari bersagli, come batteri, piastrine e proteine in condizioni di flusso standardizzate. L'implicazione di questa tecnica si estende alla nostra terapia dell'endocardite infettiva, perché può svelare importanti interazioni molecolari e fattori che guidano un'elevata infettività di alcuni tessuti.
Questo metodo fornisce informazioni sulla patogenesi della formazione della vegetazione. Può anche essere applicabile in studi che studiano la permeabilità vascolare, la mobilità cellulare e l'espressione delle cellule geniche. Per iniziare il protocollo, posizionare una biopsia tissutale precedentemente preparata di 10 millimetri di diametro e lo stesso spessore tra uno scivolo del microscopio e una perforazione circolare di otto millimetri e una guarnizione di gomma con la superficie interna rivolta verso l'alto, per contattare la sospensione batterica.
Concentrarsi sull'orientamento dell'innesto tissutale mentre è posizionato nel supporto. Assicurarsi che la superficie interna del tessuto sia già esposta alle facce del flusso sanguigno fino a contattare il mezzo sperimentale. Quindi, inserire il supporto con il tessuto nella guarnizione incorporata nel telaio metallico inferiore della camera.
Attaccare il telaio in metallo superiore con la relativa guarnizione sul fondo della camera con il porta tessuto inserito in precedenza. Quindi montare l'intera camera con otto viti e dadi a vite. Assicurarsi che l'altezza della camera sia sempre la stessa tra gli innesti utilizzando una pinza o un righello.
Collegare quindi la camera di flusso con una pompa peristaltica. Quindi collegare il serbatoio del fluido da 400 millilitri con i tubi. Perfondi i tessuti con sospensioni da 100 millilitri da dieci alle sette unità di formazione della colonia etichettate fluorescentmente in salina tamponata con fosfato con lo stress pura di tre dines per centimetro quadrato e la corrispondente portata di quattro millilitri al minuto per un'ora utilizzando la pompa peristaltica e il serbatoio batterico.
Ricircolare continuamente le sospensioni batteriche da 100 millilitri utilizzando lo stesso serbatoio di raccolta. Dopo la perfusione, smontare la camera per rilasciare l'innesto. Lavare il pezzo di tessuto due volte con quattro millilitri di PBS in una piastra da 12 pozzetti usando uno shaker orbitale per tre minuti.
Quindi tagliare la parte interna dell'innesto usando un punzone di biopsia della pelle con un diametro inferiore. Mettere ogni biopsia tissutale in un tubo separato da 14 millilitri contenente un millilitro di cloruro di sodio sterile 0,9%. Staccare i batteri dal tessuto utilizzando un bagno di sonicazione per 10 minuti.
Preparare un singolo tubo da 14 millilitri con 10 millilitri di cloruro di sodio sterile allo 0,9% per effettuare diluizioni seriali della sospensione batterica ottenuta dopo la sonicazione. Etichettare il tubo numero due. Preparare tre tubi da 14 millilitri con 10 millilitri di cloruro sterile allo 0,9% di sodio per le diluizioni seriali della sospensione batterica iniziale portata all'esperimento di profusione.
Etichettare i tubi numero tre, numero quattro e numero cinque. Successivamente, fissare tre piastre di agar, una per la perfusione batterica, una per la perfusione di controllo del PBS e la terza per la sospensione batterica iniziale utilizzata per le perfusioni. Etichettare tre settori per piastra per l'esperimento tissutale nel modo seguente:10-1, 10-3 e 10-4.
Per contare il numero di unità che formano colonie nella perfusazione batterica, etichettare la piastra come segue:10-1, 10-3, 10-5 e 10-7. Vortice i tubi contenenti la biopsia tissutale per 15 secondi ciascuno, per effettuare diluizioni seriali. Per preparare le diluizioni seriali, trasferire 100 microlitri del tubo numero uno nel tubo numero due e vortice del tubo per mescolare accuratamente la soluzione.
Stendere 100 microlitri del contenuto del tubo numero uno e numero due nei settori corrispondenti, 10-1 e 10-3 della piastra di agar. Quindi distribuire 10 microlitri di tubo numero due sul settore 10 quattro. Ripetere questo passaggio quattro volte per ottenere quattro escrezioni separate da ogni volume di 10 microlitri.
Per preparare le diluizioni seriali della coltura iniziale, prima vortice la diluizione per 15 secondi e trasferire 100 microlitri di sospensione batterica al tubo numero tre, e mescolare vigorosamente mediante vortice. Aggiungere 100 microlitri di tubo numero tre al tubo numero quattro e mescolare di nuovo. Ripetere la procedura per il tubo numero cinque dal tubo numero quattro.
Distribuire 100 microlitri del contenuto dei tubi numero tre, numero quattro, numero cinque e la coltura iniziale etichettata rispettivamente sui settori 10-3, 10-5, 10-7 e 10-1 della piastra di agar del sangue. Lasciare le piastre di agar nel sangue sotto il cappuccio laminare per asciugare all'aria le diffondezioni batteriche, in genere per 10 minuti. Successivamente, posizionare le piastre a 37 gradi Celsius per l'incubazione notturna.
Dopo l'incubazione notturna, conta le colonie batteriche per ottenere il numero di CFC. In condizioni di stress pura, è stato osservato un simile attaccamento batterico attraverso i vari tessuti di innesto sia per l'infezione da stafilococco aureo che per l'infezione da stafilococco epidermidis. Seguendo le procedure, lo streptococco sanguinis ha mostrato una significativa riduzione dell'aderenza alla parete spettrale giugulare bovina, rispetto alla macchia di pericardio bovino.
Quando si confrontano le tre specie di batteri, lo streptococco sanguinis presenta un'adesione significativamente inferiore alla parete spettrale giugulare bovina in relazione allo stafilococco aureo e allo stafilococco epidermidis. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di aver preparato tessuti corretti della stessa testa. Garantirà condizioni simili in tutti i campioni di esperimento e ridurrà al minimo la variabilità dei dati tra diverse serie di esperimenti.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica consente ai ricercatori di esplorare i complessi sistemi di disturbo passo dopo passo arricchendo i loro approcci modello in vitro con diversi elementi per costruire una piena complessità vicino allo stato medico.
