個々の細胞に蛍光タンパク質を遺伝的に標識し、時間の経過とともにそれらの細胞に従うことで、Confetti Mouseは研究者が多くの生物学的プロセスに関する新しい洞察を明らかにすることを可能にしました。当社のプロトコルは、組織採取とイメージングの間のラグタイムを最小限に抑え、任意の鉱物化または非鉱物化組織に適用することができ、数年間蛍光を保存します。この方法は、適切なCreラインが利用可能である限り、その運命とその運動学を研究するために異なる細胞集団に適用することができるので、再生医療および発生生物学のすべての分野に非常に有用である。
我々のステップバイステップの手順は、異なる蛍光タンパク質から放出される蛍光シグナルの違いを区別するための最も困難なステップを示します。まず、マウス組織をイメージング用に準備します。生後45日までのマウスから軟組織とミネラル化脛骨およびフェムソラの場合、予め冷却された3.7%ホルムアルデヒドPBSで組織を固定し、回転器で穏やかに転がしながら6時間摂氏4度でインキュベートします。
45日を超えるマウス由来の脛骨やフェムラなどの塩分化組織については、pHを8.05に調整して10%EDTA溶液を1リットル調製し、この溶液を用いてホルムアルデヒドを3.7%に希釈します。摂氏4度で一晩3.7%ホルムアルデヒドPBSでそれを維持することによって組織を修正します。翌日、予め冷却されたホルムアルデヒドEDTA溶液に入れ、48時間回転させながら摂氏4度でインキュベートし、インキュベーション中に溶液を3回交換してください。
その後、組織を予め冷却した30%スクロースに入れ、容器をつばに満たし、摂氏4度で一晩そっと回転させます。朝、スクロース溶液から組織を取り除き、最適な切断温度化合物(OCT)の5ミリリットルで数秒間リンスするために鉗子を使用してください。事前ラベル付けされたクリオマールをOCTで満たし、下部に組織を配置し、サンプルが室温で長時間座っているのを避けるために迅速に作業します。
乾氷上に金型を配置し、OCT が固化するのを待ってサンプルを埋め込みます。すぐに使用しない場合は、マイナス20°Cで保存できます。モールドからブロックを取り外します。
ブロックの上部とチャックの間にOCTを適用し、少なくとも5分間、またはOCTが完全に固まるまでクライオスタットで冷却します。サンプルホルダーとブレードホルダーをマイナス20°Cに予冷し、チャックホルダーにサンプルを入れ、ブレードホルダーにブレードを置き、数分間平衡させます。出生後の成長プレート分析のために、30〜160マイクロメートルのセクションを準備する。
凍結スタットを使用してブロックをトリミングし、適切な厚さに組織切片を切断し、スライド上でそれらを収集します。その後、空気が完全に乾燥するまで室温でスライドを乾燥させ、36ヶ月までマイナス20度で保存します。スライドを使用する準備ができたら、冷凍庫から取り出し、スライドホルダーで室温にしてください。
OCT を取り除くために、パスツールピペットでスライドに PBS をゆっくり塗布します。厚さ160マイクロメートルのセクションの場合、スライドを15分間インキュベートし、液体を取り出し、新鮮なPBSをさらに5分間塗布します。スライドを室温で75%チオディエタノールの溶液に60ミリメートルの長いカバースリップで取り付けます。
まず、チャネルタブで RFP チャネルをクリックして選択します。次に、T-PMT の横にあるチェックボックスをクリックします。スライドをスライドホルダーに置き、対象の組織を光路と対物レンズの間に直接配置します。
組織をローカライズするには、チャンネルタブのトラック見出しの下にある YFP および CFP ボックスの選択を解除します。トラックの見出しで T-PMT チャンネルを選択し、取得タブでライブをクリックし、T-PMT チャンネルのゲインを増やして、画面上の組織選択を視覚化します。適切な顕微鏡ノブを使用して、目的の領域とフォーカスを配置するためにスライドの位置を調整します。
次に、取得タブで[停止]をクリックして、レーザー露出をオフにします。原稿の指示に従って画像パラメータを定義し、必要に応じてピンホールのサイズを調整します。設定を確認して、記録された信号が重ならないようにし、[チャンネル]タブで3つのチャンネルすべてを選択して、スナップボタンを押します。
結果の画像の表示チャネル間をスクロールするには、各チャンネルの上にある青色のハイライト表示ボックスをクリックし、画面上のチャンネル間の重複を手動で確認します。シグナルが重なっている場合は、パラメータを互いに区別できるまで再び再び取り付けます。このプロトコルは、骨端軟骨軟骨に軟骨を標識し、年齢とともにそのクローン拡張を視覚化するために使用された。
中央部は、近位脛体成長板における十字靭帯およびクローンを可視化することによって決定した。Col2陽性であった個々の細胞は、タモキシフェン投与時にConfetti蛍光タンパク質で標識され、クローン膨張を受け、その後成長プレートに残った。蛍光シグナルは、長期保存後に可視化することができる。
一部のセクションは、準備とイメージングの前に3年以上保存されていました。画像解析ソフトを用いて3次元再構成を自動で行い、映像としてエクスポートした。クライオセクショニングステップ中に壊れた1つのセクションには、クローン分析を防ぐような高いレベルの再結合を持つ領域が含まれ、このプロトコルで遭遇する一般的な問題の1つを示しています。
研究の質問によっては、関心のあるセルに明確にラベルを付ける Cre 行を使用することが非常に重要になる場合があります。したがって、再結合直後にこれらの細胞の蛍光をチェックすることをお勧めします。非インクルーシブルクレラインで進行中のDNA組み換えは、それによってクローナル分析を妨げる溶出細胞の蛍光プロファイルを変更することができるので、誘導性Cre線を使用することが不可欠です。
このプロトコルは、遺伝的に操作された株、薬理学的治療、外科的介入、ならびに調製されたセクションの免疫蛍光染色のような機能的摂動と組み合わせることができる。
