この方法は、再生の分野で重要な質問に答える助けになります。そして内分泌学。多嚢胞性卵巣症候群またはPCOSおよび高アンドロゲン症の研究に適用可能である。
この技術の利点は、それが一貫した促進することです, 均一な, 高価な効果的な方法でホルモンの長期放出.手順を治療するJHは、私の研究室の技術者であるPing Xueになります。ジヒドロテストステロンまたはDHTペレット調製の場合は、カミソリの刃を使用して15ミリメートルのシリコーンチューブを切断します。
そして、鈍い20ゲージ針を装備した3ミリリットルの注射器を使用して、チューブの一端に2〜5ミリメートルの医療用接着剤シリコーンを注入します。チューブを一晩乾燥させます。そして、密閉された端に気泡を確認してください。
適切な個人用保護具を着用すると、流れの中でプラスチック製のウェイボートにDHT粉末を注ぎます。接着剤キャップチューブの開いた端を粉末に押し付けます。大きなストレートペーパークリップを使用して、DHTが適切な実験深度に達するまで、粉末をチューブに踏み込みます。
その後、チューブの開いた側を一晩シリコーンで密封します。翌朝、各密封された側を切り、DHTの両側に2ミリメートルの長さのシリコーンを得て、DHT制御ペレットを得なかった。その後、ペレットを最大3ヶ月間室温でホイルで包んだ50ミリリットルの円錐管に保管します。
PCOSマウスモデル生成のために20までのDHTまたはコントロールペレットを含む別々の50ミリリットルの円錐管で0.9パーセントの生理食塩水の30ミリリットルを含む摂氏37度で24時間。翌日、生後2ヶ月の雌マウスのつまみへの応答の欠如を確認し、滅菌ガーゼを使用してシーケンシャルなポビドネヨウ素および70%のエチノールスクラブを外科領域に投与する。次に、首の近くの皮膚を通して5ミリメートルの切開を行います。
そして、10ゲージのトロカールを使用して、ロストラル方向に15ミリメートルのトンネルを作ります。トロカールを使用してペレットをトンネルにドーサリーに挿入し、外科用接着剤で切開を密封します。手動で鉗子で創傷の端を近似し、穏やかなブラッシングストロークを使用して、液体接着剤の3つの薄膜層を対向した創傷エッジの両側から1センチメートルに塗布する。
その後、完全な再実行まで監視とヒートパッド上のケージに一人でマウスを置きます。アンドロゲン暴露の一定レベルを維持するために4週間ごとにペレットを交換します。ペレット挿入の3日後、p10ピペットを使用して10マイクロリットルの無菌生理食塩水を膣腔に噴出し、ピペットチップを使用して生理食塩水をすぐに回収します。
膣細胞生理食糸サンプルをラベル付きスライドに広げる。そして、生理食糸を室温で乾燥させます。乾燥したスライドを100%エチノールの容器に少なくとも5分間固定します。
次に、スライドをバッファーBにそれぞれ1分間染色し、dif-quick染色キットからCをバッファーします。バッファーの終わりにCインキュベーションは、3秒間水道水でスライドを洗浄し、室温でそれらを乾燥させます。エストルース環状性を決定するために、光顕微鏡の10倍の目的の下でスライドを見る。
各ステージの日数をカウントし、各ステージでの時間のパーセントを計算する合計日数で除算します。グルコース耐性を試験するために、DHT挿入を20日間、マウスを一晩速くする。翌朝マウスの体重を量り、グルコメーターとテストストリップを使用して、尾静脈血のバジルグルコースレベルを測定する。
20%デキストロースの体重1キログラムあたり2グラムでマウスを注入します。次に、デキストロース投与後15、30、60、90、120分で尾静脈血液サンプルのグルコースレベルを測定する。DHT挿入ダムから雌の子孫を取得するには、ペレット挿入に続いて、15日目に証明された肥沃な男性とケージでテストされた女性のマウスを移動します。
毎週ダムの体重を文書化して、マウスが妊娠しているかどうかを判断します。出生後7日目に、ランセットの先端をタトゥーペーストに浸し、つま先に入れ墨を付けます。マークされたマウスの体重は、70日齢まで7日ごとに測定されます。
出生後12日から16日の間に、図に示すように、マウスを耳に打ち込み、システムに従って番号を付ける。性別を区別するには、タグ付けされた各マウスの腹側を調べる。メスは目に見える乳首を持つことになります。
様々な下流分析のための血液サンプルを収集するには、ランセットを使用して、顎下静脈出血によって9時から10時の間の血液のおよその実験量を収集する。そして、血清採取を可能にするためにサンプルを遠心分離する。その後、分析までマイナス80°Cで1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに血清サンプルを保存します。
DHT女性の子孫の思春期を評価するには、出生後21日目に離離した後、毎日、目視検査によって膣の開口部をチェックする。そして、アノ生殖器の距離を測定するためにキャリバーを使用してください。血清DHTの絶対値は質量分析とエリサ分析では異なりますが、DHTと非DHT挿入の相対的な民俗変化はアッセイと実験の両方から似ています。
DHTレベルは、DHTおよびDHTマウスなしの両方で妊娠を通じて受胎前から有意に増加する。しかし、DHTマウスでは、DHTマウスでは受胎前および妊娠時の両方の時点でDHTマウスがないのに比べてDHTレベルが2倍高い。成人のDHTの娘は生殖機能の違いを示す。
例えば、メステス・ダイスで有意に長い時間を経験し、前エステルおよびエステル系で有意に長い時間を経験する成人のDHT娘と比較して、破壊されたエーテルの周期性。この手順を試みている間、彼らはホルモンの均一な放出に使用される前に24時間のペレットをインキュベートすることを覚えておくことが重要です.この手順に従って、DHT曝露の生殖および代謝の結果も調べることができる。
開発後、この技術は、エンドロクロノロジーと母体胎児の相互作用の分野の研究者がPCOSと女性マウスにおける低レベルの高アンドロゲン症の影響を研究する道を開きました。DHTでの作業は非常に危険であり、手袋やマスク、ゴーグルの着用、バイオセーフティフードでの作業などの予防措置は、常にこの手順を実行しながら取るべきであることを忘れないでください。
