こんにちは、私の名前はビパシャ・ボーズ博士です。インド、マンガロール大学イェネポヤ大学イェネポヤ研究センター、幹細胞再生医療センターの助教授と担当を務めています。次に、さまざまな紫外線-C線に曝されたマウスの眼球表面から生きた培養物における活性酸素種であるROSの存在を検出する方法を示します。
この技術の利点は、ベスター細胞を持たずに、活性酸素種、生細胞および死細胞の存在を同時に検出できることです。この技術の原理は、基本的に色素DCFDAの生細胞透過性にある。DCFDAは、酸化ストレスの間に細胞内酸化酵素によって作用され、緑色の蛍光DCFに変換される無色色の色素を意味する生細胞です。
したがって、緑色の蛍光は、生細胞内の活性酸素種の存在を検出することを可能にする。一方、ヨウ化プロピジウムは、赤を蛍光する色素を意味する排他的に死んだ細胞である。rDNA二本鎖インターカリング染料である。
しかし、染料のHoechstは、生きている細胞と死んだ細胞の両方に対して意味されます。青い色の核染色です。したがって、これは、死細胞の評価と共に、長期培養における活性酸素種の存在を時間依存的に検出できる非常に簡単な方法です。
プレートポイント 35 ミリメートル培養皿あたり 200 万個のセル。私たちが適用している細胞は、マウスの眼の表面からの細胞です。各細胞培養皿から最大量の培地を除去します。
約500マイクロリットルの細胞培養培地を細胞と密接に接触させます。最小限の量の培地は、細胞の乾燥を防ぐことができます。しかし、最小限の量のメディアの目的は、UVC露光の最大の浸透を可能にすることである。
UV源の下で細胞を取る、それはUV架橋機、または他の任意の紫外線-C源であることができる。1、10、100、1、000、および10,000ジュール/メートル四角などのUVC放射の異なる投与量に細胞を露出させる。細胞が紫外線-C放射にさらされた場合、蓋は開いた位置にあるはずです。
これにより、細胞への紫外線-Cの最大の浸透が可能になり、したがって、紫外線-C放射に対する細胞の最適な線量応答を示す。層状空気流フードに細胞を持って来て、完全な媒体の2ミリリットルで皿の各々を補充する。この完全な培地には、DMEMに20%のウシ胎児血清が含まれ、1%の最小非必須アミノ酸、ペニシリンおよびストレプトマイシンである1%の抗生物質などのサプリメントを補う。
その後、最大体積で補充した後、2ミリリットルの完全な培地を、プレートをインキュベーターに戻し、紫外線-C放射の早期効果を見るために3時間インキュベートする。UVC細胞インキュベーション後3時間の最後の15分間に生細胞染色培地を準備します。染色媒体は、DMEMを含む10%FBSで37度に予め温め準備される。
10ミリリットルの染色媒体を作るためには、まず5マイクロモルの最終濃度を得るために10ミリモルのストックからDCFDAの5マイクロリットルを加える。上下にピペットを入れ、よく混ぜます。第二に、mL当たり10ミリグラムのストックから5マイクロリットルのHoechst溶液を加え、mL当たり5マイクログラムの最終濃度を得る。
今、上下にピペットでよく混ぜます。最後に、1 mL当たり1ミリグラムのストックからヨウ化プロピジウム200マイクロリットルを加え、1mL当たり20マイクログラムの最終濃度を得る。上下にピペットを入れ、よく混ぜます。
これで染色液が使用可能になりました。3時間のインキュベーションポストUVC露光後、CO2インキュベーターからプレートを取り出します。1、1、10、100、1、000、10,000、10,000ジュールなどのUVCの様々な投与量に曝露された各皿から培地を吸引する。
今、料理の側面から穏やかに料理のそれぞれに作りたてのライブセル染色メディアの2ミリリットルを追加します。プレートを再びCO2インキュベーターに戻し、生細胞染色のために15分間インキュベートします。生細胞染色媒体で15分間のインキュベーションの後、異なる紫外線-C放射に曝された細胞を含む各ディッシュから染色培地を取り除く。
完全な培地の2ミリリットルで細胞を補充します。これで、セルを表示する準備ができました。次に、コントロールセルを蛍光画像の明視野の下に配置します。
彼らはコントロール細胞であるため、細胞は明らかに正常に見えます。青いフィールドの下で、蛍光合計細胞をすることができます。緑色のフィールドの下に ROS 生成が表示されます。
これらはコントロールセルであるため、ROSは生成されません。赤色のフィールドの下には、ヨウ化プロピジウム染色死細胞が見える。その後、UVが明視野の下でメートルの正方形あたり100ジュールを露出保ちます。
青のフィールドの下に、青のフィールドの下に合計セル番号を表示することもできます。しかし、緑色のフィールドに曝露すると、DCFDA陽性細胞が見られ、PI陽性死細胞も見られます。最後に、最大UV線量(1メートル平方露出セルあたり10,000ジュール)を明視野下に置きます。
異常な細胞形態を見ることができます。しかし、青のフィールドの下には、合計青いセルが表示されます。緑色のフィールドの下で、緑色蛍光DCFDA陽性細胞がROS生成を示す見られる。
細胞が赤色のフィールドに曝露されると、全ての細胞が、UV投与量の1メートル平方あたり10,000ジュールで処理される場合に多数の細胞死を示す赤色の蛍光を発した。さまざまなチャンネルで撮影した画像を、紫外線-C線量と非露出コントロールに対応する単一の合成画像パネルに配置します。画像はグループ内の単一のパネルに配置されます。
まず、明るいフィールド。第二に、ホーチストブルー核染色。第三に、ヨウ化プロピジウムは死核に関して染色する。
第4に、ROS陽性細胞のDCFDA。そして5番目に、マージされた画像。1メートルあたり1ジュールのUVC線に曝露された未露光対照と細胞の第1列と第2列を見ると、PIもROS陽性細胞も点灯していないことが観察され、それによって、非露出制御におけるROSおよび細胞死の完全な欠如と、1メートル当たり1ジュールの低UVC用量を示した。
今、メートル四角形あたり100ジュールにさらされた細胞の合成画像の3行目に来る。細胞の割合が非常に低いのは、約10%がこの用量でPIおよびDCFDAの両方に対して陽性であったが、それにより、ROS生成および細胞死の少量を示す。次に、合成画像の4列目に示すように、UVC放射被ばくのさらに高い線量、つまりメートル平方あたり1,000ジュールに移ります。
ここで、細胞の約70%がPIおよびDCFDAに陽性であった。最後に、合成画像の5行目に示すように、最大用量のUVC露光(メートル平方あたり10,000ジュール)に移ります。ここで、ほぼ100%の細胞がPIおよびDCFDAの両方について陽性であったことが分かったが、これにより、この特定のUVC用量で100%の細胞死およびROS生成を示す。
イメージをイメージング ソフトウェアに転送します。まず、Hoescht染色された核、すなわち細胞の総数を示す青色の画像を開きます。カウントツールを開き、番号を表示するために、各セルを 1 つずつクリックします。
今度は、PI陽性死細胞を示す赤いチャネルの下でキャプチャされた画像を開きます。カウントツールを開き、PI陽性死細胞の数を示す赤いスポットをそれぞれクリックします。死んだ細胞のカウントが終わったら、緑色のチャンネルで取り込まれたセルをクリックし、カウントツールを開き、ROS生成を示すセルを示す緑色のスポットをそれぞれクリックします。
緑色のチャネルの下でキャプチャされた緑色の細胞のカウントを完了し、式を使用して、UVC損傷による細胞死の割合とUVC損傷によるROS産生の割合を列挙する。これは、PI陽性細胞の単純な式数、すなわち赤色蛍光細胞を用いて、Hoechst陽性細胞の数を100倍にした値で割ったものである。UV損傷によるROS産生の割合は、式、DCFDA陽性の数、または緑色蛍光細胞を使用して、Hoechst陽性細胞の数を100倍にした回数で割って計算する。
細胞死の割合とROS生産の割合の両方を持った後、これらの値を使用して棒グラフをプロットします。X軸はUVの投与量を示し、y軸は細胞の割合を示す。緑色のバーはROS生成の割合を示し、赤色のバーは細胞死の割合を示します。
分析の際、UVC用量100ジュールで10%ROS生成細胞と10%細胞死があることは明らかである。一方、UVC用量10では1メートルあたり3ジュールに上げられ、70%の細胞は細胞死と同様にROS生成を示した。UVCの最高用量では、10が1メートル平方あたり4ジュールに引き上げられるが、約100%の細胞はROS産生と同様に細胞死を示した。
したがって、ROS生成と細胞死との間には強い正の相関があると結論することができる。結論として、この技術は、活性酸素種、生きている、正常なイベント培養中の生きている細胞と死んだ細胞の同時評価のために非常に便利です。この技術は、紫外線、または化学薬品などの様々な細胞損傷剤に曝された長期培養において、活性酸素種、生細胞および死細胞の限定的な評価にも有用である。
また、この技術は、QR to PCRやウェスタンブロッティングなど、多くの下流アプリケーションに対して可能な限り、50%ROS、75%ROSなどで細胞を収穫するのに最適な時期を決定するための研究者を導くことができます。
