マイクロパターニングは、細胞応答を研究して、細胞が生物に遭遇する生化学的および生物物理学的シグナルを定義することを可能にするので、非常に強力なツールです。他の方法とは対照的に、説明する方法はパターン生成に対してより柔軟である。例えば、再現性の高い複数のタンパク質の勾配やマイクロパターンの生成が可能です。
我々のグループは、LIMAPを用いて神経経路探索を研究するだけでなく、細胞の増殖、分化、および移動に影響を与えるシグナルに対する他の細胞の反応を研究しています。マイクロパターニングは、細胞生物学における基本的な質問に答えるために使用されます。得られた知識は、再生医療における既存の装置、例えば末梢神経損傷後の神経修復を変更するために使用することができる。
まず、デジタル描画ソフトウェアでパターニングするためのテンプレートを設計します。画像サイズとして、長さ 1,824 ピクセル、幅 1,140 ピクセルを選択します。テンプレートをデザインし、テンプレートを 8 ビット TIFF ファイルとして保存します。
パターニングの前に、1,000~1,300ミリトールのプロセス圧力と29.6ワットの電力を1〜5分間使用して、プラズマクリーナーで表面を清掃してアクティブ化します。20ミリメートルのインナーウェルサイズと0.16〜0.19ミリメートルのガラス厚さのガラス底皿を使用してください。テスト対象の条件の数に応じて、6ウェルまたはシングルウェル皿を選択します。
PDMSステンシルを無菌状態でカットして、内部ガラス底によく収まるようにします。無菌鉗子で内部マイクロウェルフィリングを取り外し、ガラスによくステンシルを貼り付け。PBSで0.1ミリグラム/ミリリットルPLL-PEG溶液を調製し、各マイクロウェルに20マイクロリットルを加えます。
その後、室温で1時間インキュベートします。インキュベーション後、各ウェルからPLL-PEGの15マイクロリットルを取り除き、乾燥させることなく20マイクロリットルのPBSで5回洗浄します。1つのウェルから18マイクロリットルのPBSを取り除き、5マイクロリットルの光導入器を追加し、残りのマイクロウェルにPBSを残して、参照パターンを作成するために1マイクロウェルを準備します。
次に、蛍光蛍光ペンを使用して空の内部ガラスウェルをマークします。目的の上に位置を決め、目的のフォーカスを調整して、PRIMOロゴとキャッチフレーズがセルの世話をする」がフォーカスされます。次に、焦点面の Z 位置を記録します。
参照パターンを作成するには、カメラを通して透過光を使用して光起即者とマイクロウェルのエッジを視覚化し、右側のメニューからROIシンボルを選択します。目的のパターン テンプレートをアップロードするには、PRIMO を選択します。マイクロウェルの周辺領域に移動し、「ロック」を選択して、Z位置のキャリブレーションに合わせてフォーカスを調整します。
次に、[再生] を選択して、参照パターンのフォトパターンを開始します。参照パターンマイクロウェルを20マイクロリットルのPBSで3回洗浄し、光始子を除去します。次いで、20マイクロリットルの蛍光標識された細胞外マトリックス、またはECM、タンパク質溶液を添加する。
室温で10〜20分間インキュベートし、リファレンスを光からよく保護します。インキュベーション後、18マイクロリットルのタンパク質溶液を取り除き、20マイクロリットルのPBSでウェルを3回洗浄します。蛍光顕微鏡を使用して、参照パターンを可視化します。
カメラパスを通してパターンエッジに焦点を合わせ、最適な焦点に従ってZ位置を記録します。この位置は、後続のパターニングに使用される最適なレーザー焦点になります。滅菌条件下では、すべてのマイクロウェルからPBSの18マイクロリットルを除去します。
各ウェルに光起分器の5マイクロリットルを加え、上下にピペットを入れ、均質化します。同じマイクロウェル内で複数のタンパク質をパターニングする場合は、必要なパターンテンプレートのセットをすべて同時にアップロードします。次に、行数、列数、および線量を選択します。
テンプレートの構成をファイルとしてソフトウェアに保存します。参照パターンが生成された領域に移動し、最適な Z 位置にフォーカスを調整します。次に、[再生] を選択してフォトパターンを開始します。
フォトパターン化が完了すると、デザイン単位が赤から青に変わります。20マイクロリットルのPBSで3回洗浄して、マイクロウェルから光刺激器を取り除きます。最後の洗浄後、各マイクロウェルから18マイクロリットルのPBSを取り除き、20マイクロリットルのECMタンパク質溶液を添加します。
室温で20~30分インキュベートし、光から守ります。次に、15マイクロリットルのECMタンパク質溶液を除去し、20マイクロリットルのPBSを用いてマイクロウェルを3回洗浄する。クロス結合を防ぐには、20マイクロリットルのPLL-PEG(BSA)をマイクロウェルに加え、暗闇の中で室温で1時間インキュベートします。
次いで、ブロッキング剤の15マイクロリットルを取り除き、20マイクロリットルのPBSですべてのマイクロウェルを3回洗浄する。PBSの18マイクロリットルを取り除き、各マイクロウェルに光刺激体の5マイクロリットルを加え、光刺激体がマイクロウェルの全面で均質であることを確認する。最初のマイクロウェルに移動し、前に保存したテンプレート設定をロードします。
次に、第 2 ラウンドのフォトパターン作成にパターン化するアクションを選択し、最初のラウンドからアクションの選択を解除します。フォトパターニング後、PBSで洗浄してPLPPを取り除きます。次いで、第2のECMタンパク質溶液で20分間インキュベートし、20マイクロリットルのPBSでマイクロウェルを3回洗浄する。
蛍光顕微鏡を使用して、印刷されたパターンを視覚化して画像化します。細胞をプレートする準備ができたら、内側のガラスによく細胞を持つ培地の1ミリリットルを追加し、すべてのマイクロウェルをカバーすることを確認します。そして、培養皿を摂氏37度、および5%の二酸化炭素インキュベーターに入れます。
生成されたパターンがテンプレートの正確な表現であることを確実にするために、各ストライプに沿って、および各ストライプの上の対応する背景領域から蛍光強度測定が得られます。再現可能な定義済みのマイクロパターンは幅20~2マイクロメートルの範囲で達成されますが、20マイクロメートル以上のプリント機能を使用するとエッジ効果が得られます。定義されたタンパク質濃度は、タンパク質の様々な濃度でインキュベートするか、または抗接着フィルムを切断するために使用されるレーザー用量を変化させることによって得られる。
レーザー強度はテンプレートのグレースケールレベルに比例し、UV照明の勾配を生成します。勾配ストライプに沿った蛍光強度プロファイルの測定は、パターンテンプレートで線形であり、生成された勾配パターンにおいて行われます。このプロトコルは、フィブロネクチンの水平ストライプを持つクロスパターンやラミニンの垂直ストライプなど、同じマイクロウェル内の複数のタンパク質を持つマイクロパターンを作成するために使用することができます。
しかし、タンパク質のクロス結合を防ぐためにブロッキングステップが必要です。生成されたクロスパターンは、その後、ニューロン細胞株、またはCAD細胞、または一次ニューロン、ラットDRGを有する細胞アッセイに使用することができる。このプロトコルを実行する際に覚えておかねばならない最も重要な側面は、適切なシステム較正を行い、マイクロウェルが複数の洗浄工程で乾燥しないようにし、タンパク質のインキュベーションとブロッキングに適切なパラメータを使用することです。
細胞行動の分析は、典型的には、蛍光、タイムラプス、AFMなどの顕微鏡検査を伴う。さらなる特徴付けは、遺伝子発現プロファイリングなどの他の生化学的方法を含むことができる。
