このプロトコルは研究者が生きているセルのexoそしてendocytosisを監視することを可能にする細胞膜のために特定新しいpH敏感な蛍光脂質の調査の性格描写そして適用を記述する。pH感受性緑色蛍光タンパク質に基づく膜タンパク質に関する以前のほとんどのレポーターは、間接的です。脂質模倣物として、ND6は細胞膜に組み込まれるため、脂質膜の輸送を忠実に報告します。
ND6プローブは、生体膜環境に埋め込まれた場合にのみ蛍光を発します。そのプローブの蛍光強度は、ピペラジンヘッド基のプロトン化および脱プロトン化と相関しています。したがって、より低いpHではるかに強い蛍光を発します。
エキソサイトーシスとエンドサイトーシスは、多くのシグナル伝達分子の分泌と取り込みの根底にある普遍的なプロセスです。したがって、ND6は、細胞生物学および生物医科学におけるいくつかの基本的な問題を研究するために使用できます。手順を実演するのは、私の研究室の学生であるヘイリー、オリバー、ジョナサンです。
まず、生細胞蛍光イメージング用の温度制御と溶液入力出力を可能にするイメージングチャンバーを準備します。プログラム可能なデバイスをセットアップして、灌流溶液を切り替え、イメージング中に定義された時点で電気刺激を送達します。ND6を適量ります。
ジメチルスルホキシドに溶解し、室温で可溶化させます。次に、溶液を短時間超音波処理します。0.22マイクロメートルのフィルターを使用して粗原液をろ過し、大きな色素凝集体を除去します。
従来型またはマイクロボリューム分光光度計を使用して、405ナノメートルでの色素濃度を測定します。塗布する前に、浴液を使用して原液を1ミリグラム/ミリリットルの濃度に希釈します。原液は室温で暗所に保管してください。
ND6ストック溶液を最終濃度1マイクログラム/マイクロリットルで培地に添加し、インキュベートしてエンドソームなどのエンドサイトーシスされた膜コンパートメントを遍在的に標識します。シナプス小胞の標識の程度を減少させるには、自発的なニューロン活動を薬理学的に抑制します。原稿に記載されているようにシナプス小胞を選択的に標識した後、細胞を含むカバースリップをイメージングチャンバーに取り付けます。
温度センサー、灌流入力、および真空チップをイメージングチャンバーに接続します。灌流速度を毎秒約0.2ミリリットルに調整し、NBQXとDAP5を含む予熱した通常のチロード溶液の灌流を開始して、培養中の過剰なND6を除去します。焦点を調整し、接続された神経突起を持つ健康でよく広がるニューロンを含む適切な視野を見つけます。
未解決の二コロイドを含む領域の回避。ND6をロードした細胞を異なる露光時間でイメージングしてみて、最適なイメージング設定を特定してください。刺激と灌流のプロトコル、フレーム間隔、および合計持続時間を、テキスト原稿の情報を使用して設定します。
同期刺激と灌流を伴う画像取得を開始します。イメージング中の刺激と溶液交換を監視します。イメージングが終了したら、灌流を停止します。
カバースリップを取り外し、次の試験のためにイメージングチャンバーを清掃します。すべての画像ファイルをバックアップして電子コピーを作成します。データ抽出用の分析プログラムを選択して開きます。
画像スタックを開くか、解析プログラムにインポートします。バイナリマスクを生成した後、適切な領域サイズと真円度で粒子解析関数を使用して、細胞膜、エンドソーム、リソソーム、またはシナプスブートンに対応する関心領域(ROI)を求めます。視野内の無細胞領域にある 4 つの背景 ROI を選択します。
次に、選択したすべての ROI を保存します。ND6タイムラプス画像スタック内のすべてのフレームを揃えます。最初の画像を基準として設定し、XYドリフトによるアーティファクトを軽減する剛体レジストレーションを使用して残りをそれに位置合わせします。
次に、位置合わせされたイメージ スタックを保存します。保存した ROI をアライメントされた ND6 画像スタックに適用します。画像スタックのすべてのフレームのすべてのROIについて、ND6蛍光の平均ピクセル強度を測定します。
次に、統計分析のために結果をエクスポートします。バックグラウンド ROI の平均強度を計算して、選択したすべての ROI から減算されるベースライン ノイズを取得します。pH 5.5 チロイド溶液の適用中に、選択したすべての ROI について最も高い 3 つの平均強度を平均して、100% として定義される最大蛍光強度(正規化)を取得します。
50 ミリモルの塩化アンモニウムの適用中に、選択したすべての ROI について、3 つの最も低い平均強度を平均し、正規化のために 0% として定義される最小蛍光強度を設定します。各ROIの相対的な蛍光変化を、それ自身の0%および100%の強度に基づいて計算します。個々のROIデータから、平均蛍光の変化、変化速度論、その他の値またはプロットを導出します。
神経細胞にND6を負荷した後、神経突起に沿った明るい緑色の蛍光点が見られました。ND6とFM464の蛍光強度の間には強い相関関係があり、ND6によるシナプス小胞の染色も示唆された。電気刺激と高カリウム刺激の両方に応答してND6蛍光の減少が観察され、ND6がシナプス小胞膜に存在し、シナプス小胞内腔が放出中に中和されることが示唆された。
徹底的な電気刺激下で、MベータCD治療は、NDイメージングによって測定されたシナプス小胞の放出と回収を有意に減少させ、膜コレステロールがシナプス小胞のエキソサイトーシスとエンドサイトーシスを促進することを示唆しています。Baf A1は、回収されたシナプス小胞の再酸性化を急性にブロックすることにより、刺激後のND6蛍光回復を妨げました。蛍光顕微鏡法の基礎知識は必須です。
生細胞イメージングをサポートするための生理学的条件の慎重な計画は非常に重要です。NDストック溶液の濃度を正確に測定することが重要です。可能であれば、使用する前に毎回原液濃度を再測定してください。
光退色やプローブの分解を防ぐため、直射日光を避けて保管してください。
