トップダウン質量分析によるタンパク質の立体構造特性評価のためのキャピラリー電気泳動ベースの水素/重水素交換

この方法により、異なるコンフォーマーまたはバリアントを含む共存するタンパク質種の分離と、それらの高次構造の違いのオンライン特性評価を単一のCEMS測定で完了することができます。電気泳動効果を利用して、HDX反応のためのほぼ100%の持続時間環境を提供し、トップダウンMS分析のためのHDX中の共存タンパク質種の直交分離を提供します。キャピラリー電気泳動の事前調整、水素交換、またはCE HDXセットアップから始めます。

50%メタノール、49%水および1%ギ酸の混合物中で超音波処理を使用して、室温で少なくとも30分間、マイクロバイアルCE-MS界面を通る流れをきれいにする。HPC修正キャピラリーをキャピラリー電気フェレーシスまたはCE装置に取り付けます。オートサンプラーを使用して、キャピラリーをバックグラウンド電解質溶液またはBGEで10分間すすぎ、BGEで満たしたままにします。

適当な長さの未変性溶融シリカキャピラリーチューブを改質剤溶液用の注入チューブとして使用する。ユニオンと適切なスリーブを使用して、調整剤チューブを鈍い温度で気密ガラスシリンジに接続し、注入ポンプを使用して改質剤溶液でチューブを少なくとも10分間すすぎます。対応する溶液をロードしたHPCコード化されたCEキャピラリーおよびモディファイアチューブの出口を、洗浄されたCE-MSインターフェースに挿入します。

調整剤溶液が界面の先端に達するように、注入ポンプでシリンジを前進させる。組み立てられたCE-MS界面を質量分析計のナノ電子噴霧イオン化源ハウジング上に取り付ける。CE-MSインターフェースに3~5キロボルトのスプレー電圧を印加します。

改質剤溶液に注入ポンプを毎分0.1〜10マイクロリットルの範囲の流量で注入し、CE-MSインターフェースの先端で安定したエレクトロスプレーを確保します。BGEとオートサンプラーを含むサンプルバイアルを配置し、後でブランク電気泳動図とブランク質量スペクトルを取得するために使用されます。注入量と注入パラメータの関係を使用して注入量を推定する。

オートサンプラーを用いて試料溶液を2つのPSIで適当な期間注入する。0〜2PSIの範囲の注入圧力で20キロボルトの電気泳動電圧を印加することによってCE分離を開始し、電気泳動を得る。一方、イオン電流グラフが時間の関数として取得され、対応するMSスキャンが自動的に単一のスペクトルに結合されないクロマトグラフィーモードでMSデータを取得する。

空白の電気泳動図と質量スペクトルを基準として保存します。所望の濃度のタンパク質試料溶液を含む試料バイアルをオートサンプラーに入れ、電気泳動的に分離された重水素標識タンパク質種の電気泳動およびMS1スペクトルを取得する。目的の種に対して、同じ実行内でMS1スペクトルを取得した後、または後続の別の実行でタンデムMs.測定を実行します。

各測定後、キャピラリーをBGEで20PSIの圧力で少なくとも10分間フラッシュします。CEMSインターフェースとすべてのチューブを清掃し、実験の完了時に保管してください。HDXエンドポイントサンプルのデータセットをMSで直接注入モードで取得します。

低い注入圧力は、CEピークのより良い分離をもたらしたが、実験の遊走時間と持続時間の両方の増加をもたらした。HDXの反応時間が長くなると、タンパク質分析物の持続時間が短くなりました。β免疫グロブリンまたはβIGのAおよびB分散は、それらの配列中のわずか2アミノ酸残基によって異なり、EIC由来電気泳動図において2つの適切に分離されたピークを生じさせた。

重水素標識された差異は、イオンの明確な質量分布をもたらした。CイオンよりもZイオンの相対的存在量が少ない数値は、CS82とCS176との間のフラグメンテーション効率を制限するベータIGの確認における固有のジソフィ化結合のために観察された。ベータIGAから産生されるフラグメントイオンの大部分、およびベータIGBは、同様の程度の重水素取り込みを示す。

しかしながら、β IGAからの配列変動部位をカバーするより大きなセグメントは、β IGBよりも有意に大きい程度に脱送された。BGEのpHは、サンプルの等電点に応じて調整され、タンパク質凝集を防ぎ、複合体を維持しながら分離を容易にします。