このJoVEプロトコルでは、液滴ベースの単一核RNAシーケンシングを使用して、健康と疾患における心臓交感神経ニューロンの生物学的アーキテクチャを特徴付けます。この方法は、一定期間にわたるニューロンサンプルの大規模なコレクションのシーケンシングを可能にする。ハッシュタグオリゴでバーコード化された核を引っ張ることによって、この方法は、サンプルの多重化を可能にする。
この方法は、細胞サイズが大きく、サンプルの同時収集が困難なため困難であったヒト神経節のニューロンのシーケンシングに拡張される可能性を秘めています。手順を実証するには、研究技術者のConny van Munsterenと、私たちの研究室の博士課程の学生であるLieke van Roonが、解剖に必要なすべての材料を集めることから始め、解剖ボードにマウスを固定します。毛皮の分散を最小限に抑えるために70%エタノールでマウスを濡らします。
はさみで正中線カットをして首領域の皮膚を開きます。実体顕微鏡下で、下顎下腺を脇に動かし、胸骨乳様筋を除去して総頸動脈とその分岐部、ならびに上頸部神経節を露出させ、それに付着した組織を除去する。左右の頸動脈分岐部とそれに付着した組織を解剖する。
解剖した各組織片を、冷たいPBSを含む別々の3.5センチメートルのペトリ皿に移す。頸動脈分岐部に取り付けられた上頸部神経節を見つける。動脈と付着組織を除去して上頸部神経節をきれいにする。
星状神経節を解剖するには、腹部に正中線の切断を行い、続いて横隔膜と腹側胸壁を開きます。肺を取り除き、続いて心臓を取り除き、背側胸郭を露出させる。最初の肋骨のレベルで、筋大腸ロンガスの前外側の左右の星状神経節を見つけます。
周囲の組織を除去することによって鉗子で両方の星状神経節を解剖する。冷たいPBSを含む3.5センチメートルのペトリ皿にそれらを移す。鉗子を使用して、上頸部神経節および星状神経節を1.5ミリリットルの微量遠心管に分離し、500マイクロリットルの0.25%トリプシン-EDTA溶液を各管に加え、振とう水浴中でインキュベートする。
神経節が微小遠心チューブの底に沈むのを許します。上清を5ミリリットルの神経節培地を含む15ミリリットルのチューブに移す。マイクロ遠心チューブに、500マイクロリットルのコラゲナーゼタイプ2溶液を加え、振とう水浴中でインキュベートする。
インキュベーション後、組織凝集塊が検出されなくなるまでピペッティングによりコラゲナーゼ溶液に神経節を再懸濁する。細胞懸濁液を、トリプシン-EDTA懸濁液と共に神経節培養培地を入れて予め使用した15ミリリットルチューブに移す。細胞懸濁液を遠心分離し、細胞上清を廃棄する。
ペレットを270マイクロリットルのウシ胎児血清に再懸濁し、1ミリリットルのクライオビアルに移す。細胞を数えるために、5マイクロリットルの神経節細胞懸濁液を5マイクロリットルの0.4%トリパンブルー色素と混合する。混合物を血球計数器にロードし、顕微鏡下で総細胞数と生細胞数をカウントする。
次に、各クライオビアルに30マイクロリットルのジメチルスルホキシドを加え、よく混ぜる。クライオバイアルを細胞凍結容器に移し、一晩マイナス80°Cに置きます。15ミリリットルのチューブを用意し、上部に30マイクロメートルのストレーナーを取り付けます。
ストレーナーを1ミリリットルの神経節培地で予備すすいでください。クライオバイアルを液体窒素から取り出し、すぐに37°Cの水浴中で解凍し、小さな氷のペレットがクライオバイアルに残るまで解凍します。各クライオビアルに1ミリリットルの神経節培地を加えながら、バイアルを注意深く振って神経節細胞を回収する。
神経節細胞懸濁液をストレーナーにロードし、4〜5ミリリットルの神経節培地ですすいでください。緊張した細胞懸濁液を遠心分離する。上清を除去し、細胞を50マイクロリットルの細胞洗浄緩衝液に再懸濁する。
細胞懸濁液を0.5ミリリットルの低結合マイクロ遠心チューブに移す。細胞懸濁液を遠心分離する。スイングバケツローターを備えた遠心分離機は、これからも不可欠です。
遠心分離後、細胞ペレットを脱落させることなく45マイクロリットルの上清を除去する。45マイクロリットルのチルド溶解緩衝液を加え、ピペッティングにより穏やかに混合し、細胞を氷上で8分間インキュベートし、次いで50マイクロリットルの冷核洗浄緩衝液を各チューブに加える。核懸濁液を遠心分離し、核ペレットを破壊することなく95マイクロリットルの上清を除去する。
45マイクロリットルのチルド核洗浄バッファーをペレットに加え、遠心分離を繰り返し、上清を除去した。核ペレットに、50マイクロリットルのST-SBを加え、核が完全に再懸濁されるまで静かにピペットし、次いで5マイクロリットルのFCブロッキング試薬を加え、氷上で10分間インキュベートする。次に、1マイクロリットルの単一核ハッシュタグ抗体を加え、氷上で30分間インキュベートする。
インキュベーション後、100マイクロリットルのST-SBを各チューブに加える。懸濁液を遠心分離し、核ペレットを破壊することなく145マイクロリットルの上清を除去する。遠心分離を繰り返し、上清を除去する。
核ペレットを50マイクロリットルのST-SBに再懸濁し、穏やかに混合する。5マイクロリットルの核懸濁液を採取し、それを5マイクロリットルの0.4%トリパンブルーと混合して、顕微鏡下で核を数える。再度、核懸濁液を遠心分離し、核ペレットをST-SBに再懸濁して、マイクロリットル当たり1,000~3,000核の目標核濃度を達成する。
サンプルを引っ張って、所望の細胞数を達成します。ライブラリー調製のための品質管理分析は、180塩基対未満のハッシュタグオリゴ由来cDNAを示した。300から1,000塩基対までのブロードなピークは高品質の遺伝子発現ライブラリーを表し、一方、194塩基対の特異的ピークはハッシュタグオリゴライブラリーを示した。
単一核RNAシーケンシング解析により、UMAPによって可視化された12のクラスターが明らかになり、ハッシュタグ抗体がすべてのクラスターに分布しました。ハッシュタグオリゴによる特異的な標識は、Xistの発現により確認した。ハッシュタグは1〜4で女性にラベルを付け、5〜8は男性サンプルにラベルを付けた。
シーケンシングデータの品質および分解能は、交感神経細胞のクラスター5および7のTH、DBH、およびSNAP25、サテライトグリア細胞のクラスター0~3のS100B、内皮細胞のクラスター4のPECAM 1、間質細胞のクラスター8のACTA2などの主要な転写産物によって検証された。この方法を試すときは、適切な準備と、細かい解剖はさみ、鋭いピンセット、スイングバケットローターを備えた遠心分離機などの適切な機器が不可欠であることを覚えておくことが重要です。交感神経外因性心核の単一核RNAシーケンシングのための段階的なアプローチは、健康および疾患における他の関連器官および組織を神経支配する神経節を特徴付ける上で広範な適用の可能性を秘めている。
