TRAP-seqを使用すると、負傷した肝臓で再び再び行う肝細胞などの特定の細胞タイプからRNAを分離し、それらの細胞で起こる遺伝子発現変化を分析することができます。組織から不要な細胞を除去するための任意の手順を必要としません。.細胞型特異的RNAは、全臓器ライセートからの親和性精製によって単離される。
この技術は、特定の細胞が傷害にどのように反応するかを決定するのに役立ちます, 肝臓病と戦うために新しい戦略や薬物を特定するのに役立ちます.これは、肝細胞が肝傷害の異なるタイプに応答する方法を識別するために使用することができます.現在、重度の急性肝損傷の選択肢はほとんどなく、この方法は新しい治療法を手がかりにするのに役立ちます。
この方法は、脳に由来します。肝臓では、様々な細胞タイプ、肝細胞、胆管細胞、クファー細胞、内皮細胞の動的変化を調べるために使用できると思い描きました。手順を実証するには、大学院生のアンバー・ワンと私のメンティーです。
まず、穏やかなピペットで磁気ビーズを再中断します。1分以上磁気スタンドにビーズを収集し、上清を取り除きます。次に、マイクロ遠心分離チューブを磁気スタンドから取り出し、PBSを1ミリリットル加え、続いて上下にピペット処理してビーズを洗浄します。
チューブを磁気スタンドに1分以上戻し、ビーズを回収し、PBSを取り除きます。タンパク質Lコーティングビーズを調製するには、再懸濁および洗浄された磁気ビーズに16マイクロリットルのビオチン化タンパク質Lを加え、1.5ミリリットルのマイクロセントレンジフュージチューブを使用する場合は1ミリリットル、または2ミリリットルのマイクロ遠心チューブを使用する場合は1.5ミリリットルの最終体積を1ミリリットルにする1X PBSを追加します。ビオチン化タンパク質Lを用いた磁気ビーズをチューブローテーターの室温で35分間インキュベートします。
次に、チューブを磁性スタンドに1分以上置き、上澄み液を取り除き、タンパク質Lコーティングビーズを採取します。磁気スタンドからマイクロ遠心分離チューブを取り出し、3%BSAバッファーを含むPBSの1ミリリットルを加え、続いて少なくとも5回穏やかなピペットを加え、タンパク質Lコーティングビーズを洗浄します。再度、1分以上磁気スタンドにチューブを置き、上清を取り除いてコーティングされたビーズを集める。
BSAをもう4回洗う。次に、GFP抗体19C8およびGFP抗体19F7に対する抗体をそれぞれタンパク質Lコーティングビーズに50マイクログラム添加し、チューブローテーター上で摂氏4度で1時間インキュベートする。親和性マトリックスを収集するには、チューブを磁気スタンドに1分以上置き、上清を取り除きます。
磁性スタンドからチューブを取り除き、低塩バッファーの1ミリリットルを追加します。上下に軽くピレットして親和性マトリックスを洗浄し、低塩バッファーをもう2回洗浄します。低塩バッファーの 200 マイクロリットルにビーズを再懸濁し、200 マイクロリットルの親和性マトリックスを作ります。
まず、PTFEガラス管を均質化中に氷の上に置くことができるように組織粉砕機を設置する。4ミリリットルの冷たいライシスバッファーをPTFEガラスチューブに充填します。ペトリ皿の上に肝臓を置きます。
ナイフを使って200~500ミリグラムの肝臓片を分離し、PTFEガラス管に移動します。残りの肝臓組織を冷やされたマイクロ遠心分離チューブに入れ、液体窒素でフラッシュフリーズします。肝臓構造から肝細胞を解離するために少なくとも5ストロークの場合、300rpmから始まるモータ駆動ホモジナイザーでサンプルを均質化する。
ガラス管を毎回下げなさい。害虫を溶液の下に保つことによって、タンパク質の変性を引き起こす可能性のある通液を防ぎます。次に、少なくとも12の完全な脳卒中のために肝臓組織を完全に均質化するために900 rpmに速度を上げます。
ライセートを、それぞれ1ミリリットル以下のラベル付きおよび冷蔵チューブに移します。核リシスを開始するには、肝臓リセートを摂氏4度で2,000倍の10分間遠心し、上清を氷の上の新しい冷蔵マイクロ遠心チューブに移します。氷上のマイクロ遠心分離管に10%NP-40の上清体積の1/9分を加え、チューブをそっと反転させて溶液を混ぜます。
ミニ遠心分離機でマイクロ遠心チューブを素早く回転させ、サンプル量の1/9分の1を10%DOCに加え、マイクロ遠心チューブを優しく反転させ、マイクロ遠心チューブを素早く回転させ、氷の上で5分間インキュベートします。核ライゼを摂氏4度で20,000倍の10分間遠心分離し、上清を氷上の新しい冷蔵マイクロ遠心分離管に移す。
各チューブについて、免疫沈降制御前として上清の総体積の1%を取り出す。一晩摂氏4度のチューブ回転器に免疫前沈降制御を置きます。ピペット処理で親和性マトリックスを穏やかに再中断し、各サンプルに200マイクロリットルを加えます。
チューブ回転機に穏やかな混合で一晩摂氏4度でライセートをインキュベートします。RNAを単離するには、ミニ遠心分離機にライゼートを含むチューブを素早く回転させ、少なくとも1分間磁気ラックに置いてビーズを回収します。追加のマイクロ遠心チューブに上清を収集します。
各チューブに新鮮な高塩バッファーを1ミリリットル加え、その後、泡を導入せずに少なくとも5回は穏やかなピペットを加えます。氷上の磁気スタンドにビーズを1分以上集め、上清を取り除きます。洗浄手順をさらに4回繰り返します。
次に、磁気スタンドからマイクロ遠心チューブを取り出し、室温で5分間温めます。0.7マイクロリットルのβ-メルカプトエタノールでビーズを100マイクロリットルのリシスバッファーに再懸濁し、親和性マトリックスから結合RNAを放出する。最高速度で少なくとも5秒間チューブを渦し、すぐにスピンダウンします。
その後、室温でチューブを10分間インキュベートする。チューブを磁気スタンドに少なくとも1分間置き、上清を回収し、キット内のRNA浄化プロトコルに従ってすぐにRNAクリーンアップに進みます。単離されたRNAの最高品質を達成するために、DNase消化および60°Cへの溶出バッファーの推奨予熱を含むすべてのRNA溶出ステップを含むすべての任意のステップを実行します。
本研究では、GFP-L10A融合とFahトランス遺伝子を、トランスポゾン含有プラスミドトラップベクター内で流体力学的注射によって肝臓に共送した。ニティシニンの除去は、有毒な肝障害を誘発した。免疫蛍光染色は、2週間の肝臓再集団の後にFAHとGFP-L10A融合タンパク質および再ポピュレーション肝細胞の共発現を確認した。
静止サンプルは、すべての肝細胞がAAV8-TBG-Cre注射後にGFP-L10Aを発現するため、融合タンパク質の最高収率を生み出した。逆に、GFP-L10Aトランスジーンを持たない野生型コントロールでは、ほとんどRNAが検出可能ではなく、TRAP手順が非常に特異的でバックグラウンドが低いことを示しています。TRAPをGFP-L10A導入肝細胞で再集団化した肝臓組織に使用した場合、豊富な高品質RNAが得られた。
対照的に、陰性対照試料のバイオアナライザを介してRNAトレースは検出されなかった。Gsta1発現は、静止肝細胞と比較して肝細胞を再導入する際に10倍以上に誘導されたが、入力RNAの欠如のために野生型マウスからのTRAP分離RNAでは閾値サイクル値は検出されなかった。組織を均質化する際には、気圧を防ぐために、害虫をゆっくりと動かしてください。
RNAを単離した後、ハイスループットシーケンシングまたはqPCRを行い、遺伝子発現を解析することができる。TRAP-seqでは、RNAを肝細胞の再導入から特異的に分離し、肝臓再集団における遺伝子発現の変化を解析する方法を有するようになりました。これにより、このプロセス中に変化する遺伝子と肝臓損傷の治療のための潜在的な治療標的を同定することができます。
シクロヘキシミドとDTTは、いずれも毒性がある。廃棄物は、制度上のガイドラインに従って回収し、廃棄する必要があります。
