We thank Cindy Voisine and Yoko Shibata for helpful discussion and critical comments on the manuscript. We acknowledge the High Throughput Analysis Laboratory (HTAL) and the Biological Imaging Facility (BIF) at Northwestern University for their assistance. This work was funded by grants from the National Institutes of Health (NIGMS, NIA, NINDS), the Ellison Medical Foundation, and the Daniel F. and Ada L. Rice Foundation (to R.I.M.). C.I.N.-K. was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (KR 3726/1-1).

1.モニタリング経細胞は、in vivoタイムラプスイメージングにより、プリオン様タンパク質の広がり注：C.を育てる注意深くエレガンス野生型（WT）（N2）とトランスジェニック系統の標準的な方法に従ってとは、培養温度47を制御する。 <ol><li> C.のトランスジェニック系統を生成しますエレガンス単量体赤色蛍光タンパク質（mRFPと）でタグ付けされたプリオン様タンパク質を発現する。マイクロインジェクション48を使用する方法を示し、このビデオを見る。これらの染色体外の行を統合する方法を説明し、さらに詳細及び方法については、49を参照してください。 </li><li>卵は、標準的な方法50に従って敷設又は漂白によって同期集団を準備します。 <ol><li>産卵による同期<ol><li>転送10から20妊娠プレート上の大人とそれらの1のために卵を産むましょう - 2時間。プレートから大人を削除し、子孫が希望歳までに成長しましょう​​。 </li></ol></li> &lt;漂白によるLI&gt;同期<ol><li>妊娠大人の非同期の人口を収集し、アルカリ性の次亜塩素酸ナトリウム溶液（250 mMのNaOHおよび1：H 2 O中の市販の漂白剤の4（v / v）で希釈）でそれらを漂白。二回（1分間218×gで）M9バッファ47（21 MMNA 2 HPO 4·7H 2 O、22 mMKH 2 PO 4、86 mMNaCl、1 mMMgSO 4·7H 2 O、1までのdH 2 Oを追加すると、卵を洗うL）。 </li><li>彼らは20℃で穏やかに撹拌し、O / NでM9バッファーに孵化することを許可する。ワームの開発が同期集団を残し、食料源の非存在下でL1段階で阻止するであろう。 OP50 E.を播種し、新鮮な線虫の成長メディア（NGM）プレート上になL1を転送大腸菌とは、子孫が希望する47歳まで開発してみましょう。 </li></ol></li></ol></li><li> 50を説明するように顕微鏡スライド上に（H 2 O）2％アガロースパッドを準備します。 <ol><li> 2マイルを準備その全長にわたって配置された表示用テープとcroscopeスライドをスペーサーとして使用する。それらの間の第三の顕微鏡スライドを置きます。 </li><li> H 2 Oおよびクリーンスライド上にピペット1滴の2％アガロースを溶解する。 </li><li>寒天ドロップの上に他の3つのスライドに垂直な第四のスライドを置きます。静かにラベルテープと同じ厚さにパッドを平らにするためにそれを押し下げます。 </li><li>スペーサを取り外し、静かに離れてスライドを引いて前に1分間、それが乾燥してみましょう。寒天パッドは、それらのいずれかに固執します。 </li></ol></li><li>白金線のピックを使って、パッドと転送〜10匹の動物にピペット〜10μlの麻酔薬（M9バッファーで2 mMのレバミゾール）。カバースリップ（〜22×22 mm）ので覆い、1時間以内に画像を撮影する。 </li><li>あるいは、より長い期間にわたって動画を取得するか、さらに、動物の任意の動きの可能性を低減するために、麻酔薬およびビーズ固定化51の組み合わせを使用。 <ol><li> 10％のAGAを準備（M9バッファ内の）51を説明し、3μlのナノスフェアサイズ標準溶液へのワーム（ポリスチレンビーズ、100nm）を加えた3μlの麻酔薬（M9バッファーで4 mMのレバミゾール）を追加すると、パッドの増加となりました。カバースリップで優しくカバー。乾燥を避けるために、VALAP（ワセリン、ラノリン、パラフィンワックスの等量混合物）を用いてカバースリップをシールする。 </li></ol></li><li>画像は、共焦点顕微鏡を使用してワームを固定化した。 注：結果は、EM-CCDカメラとのMetaMorphなどの顕微鏡オートメーションおよび画像解析ソフトウェアを備えたスピニングディスクAF共焦点顕微鏡を用いて得られ、以下の仕様の概要を説明するが、他の同等の共焦点撮像システムも使用することができるされている。 <ol><li> 63Xまたは100X / 1.4NA油浸対物を使用して、顕微鏡スライドホルダーにワームを含む顕微鏡スライドを配置。 </li><li>ソフトウェアを開きます。 mRFPとイメージング用のレーザパワーとフィルタを調整します。 10％の電力とエミッションフィルタ&gt; 600 nmで561 nmのレーザーを使用してください。 </li><lI&gt;開く &quot;多次元取得」。 「メイン」タブで、「微速度撮影」と「ファイル名を指定して実行ジャーナル」（：オフハードウェアオートフォーカス）のチェックボックスをオン。 </li><li> 「保存」タブで選択したり、ファイルを保存するディレクトリのフォルダを作成します。ファイルに名前を割り当てます。 </li><li> 「ウェーブ長」タブの下で適切な照明を選択して、露出とゲインを調整します。 （ライブ画像を用いて評価）個々のサンプルに応じて、100と300ミリ秒と100と300の間で、カメラのゲインと露出で「YokoQuadレッド」（またはmRFPを撮像のための同等の照明設定）を使用します。 </li><li> 「微速度撮影」タブで「時間ポイント数」= 301、 &quot;時間&quot; = 5分および「時間/間隔」= 1秒を選択します。 </li><li> 「AFCのSET ZのHOLD」と「AFCリターンのZ HOLDに」、種類：：＆ &quot;ジャーナル」タブでジャーナルを選択＃8220;スペシャル」（2回）、初期点：「スタート時点」と「時点の終わり」。このオートフォーカスオプションは、画像より長期間にわたって同じセクションに重要です。 </li><li>セットアップが終了したら、Enterキーを押して「取得」。タイムラプスビデオは、独立したTIFFファイルとしてリコールセーフされている。 </li><li> ImageJの中で与えられた時系列のすべて.TIFFファイルを開きます。 「イメージ」→「スタック」→「スタックへのイメージ」に進みます。必要に応じて、→「ファイル」の下にムービーを書き出すなど、サイズバーを追加、明るさとコントラストを調整→「AVI ...」「名前を付けて保存」（例えば、ビデオ1と2は図1を対応する参照）。 </li></ol></li></ol> 2。細胞自律と非細胞自律を調査するために折りたたみセンサーおよびストレスレポーターを使用すると、タンパク質恒常性と毒性に影響<ol><li>折りたたみセンサやストレスreporteを同時発現するトランスジェニック系統を生成しますプリオン様タンパク質と一緒にrを。十字架を確立するか、トランスジェニック系統を生成する方法の方法については、48,49,52を参照してください。 C.のリストについては、表1を参照してください使用することができる。エレガンス株 。 </li><li>トランスジェニック動物の同期化された集団を準備し、（セクション1.2）50上記のように希望歳までに成長します。 </li><li>実体顕微鏡を用いて、折り畳み式センサやストレスレポーターのそれぞれの表現型を調べる。 <ol><li>折り畳みセンサーは、同期後に各日の凝集体を保有する動物の数を決定する（例えば、 図2EおよびF参照）。 </li><li>ストレスレポーターのために、テストレポーターの増加した蛍光のプリオン様タンパク質の共発現の結果（例えば、 図3を参照）場合。 </li></ol></li></ol> C.におけるプリオン誘導毒性の抑制3.ゲノムワイドスクリーンエレガンス<img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52321/52321fig4highres.jpg" /> のRNAiスクリーニングプロトコルの4略図を図。個々のステップの詳細については、プロトコルセクション3を参照してください。 <ol><li> C.の同期虫ワームおよびRNAiライブラリの重複<ol><li> RNAiスクリーニングのために、AhringerのRNAiライブラリ（またはビダルのRNAiライブラリ）53,54を使用しています。 10％グリセロールを補った100μlのLB-アンプメディアとプレート（LB中の50μg/ mlのアンピシリン）を充填することにより、96ウェルプレートにオリジナルの384ウェルフォーマットからのRNAiライブラリをRearrayと96ピンレプリケーターを使用して接種する。 -80℃で攪拌し、店舗で37℃CO / Nで成長する。 </li><li> C.を維持虫 WT及び20℃のNGMプレート上でのトランスジェニック系統をOP50 E.を播種標準的な方法47に従って大腸菌 。 </li><li>漂白によってプリオンドメイントランスジェニックおよびWT（コントロール）線虫を同期する（セクション1.2を参照）。 </li><li>ワームが漂白されていることを同じ日に、50μg/ mlのアンピシリンを補充したLBメディアを準備。分配するために、自動試薬ディスペンサーを使用する（またはピペット手動で）、96ウェルプレートの各ウェルにLB-アンプ培地65μlの。 </li><li> -80℃から96ウェルAhringerのRNAiライブラリプレートを取り外し、ペーパータオルで並んで無菌フードにそれらをもたらす。すぐにプレートがまだ凍結されている間、プレートの外側に氷からの汚染を避けるように注意しながら、上下逆さまにプレートを保持することにより、シールテープを取り除く。プレートを再反転し、それらを約30分間解凍しましょう​​。 </li><li> 1のRNAiライブラリのプレートに1無菌の96ピン·レプリケータを浸し、その後1新鮮なLB-Ampプレートに。各プレートのために新鮮な無菌のレプリケータを使用してください。接着剤箔テープですべてのプレートを密封し、-80℃にライブラリプレートを返す。リプリケータは、漂白剤に浸しすすぐことができ、そして再使用するオートクレーブ処理。 </li><li>複製されたのRNAiプレートを37℃、300rpmに設定したインキュベーター中でO / Nを成長させる。 HT115 Eを使用するには大腸菌対照として空のベクター（L4440）を保有する細菌は、培養チューブに分けて、それを成長した後、2枚の96ウェルプレートの四分の一にマルチチャンネルピ ​​ペットとの文化の65μlのピペット。 </li></ol></li><li>細菌のdsRNA生産やワームの追加の誘導<ol><li>希釈しイソプロピルβ-D- thiogalactopyranosid（IPTG）のddH 2 Oで5 mMの濃度まで希釈されたIPTG10μlのは、RNAi細菌と対照プレートの各ウェルに（手動またはピペット）分配するマルチチャンネルヘッドを自動化されたワークステーションを使用してください。バックインキュベーターにプレートを再シールして配置します。それらは、37℃で3時間振盪しましょう​​。 </li><li>細菌が揺れている間、ワームを準備します。ガラス顕微鏡スライドに - （10μL〜5）少量のサンプルをよくM9 /ワームのサスペンションを混ぜ、ピペット。カウント実体顕微鏡下でのワームの数と、1μl当たりのワームの数を計算する。 </li><li> 0.20 mg / mlのIPTG、8.0 / mlのコレステロール、50μg/ mlのアンピシリン、9.6 / mlのテトラサイクリン、0.0835 / mlのファンギゾン、および：無菌技術を用いて、以下の最終濃度を補充したM9（M9 +）の溶液を調製する50μLあたり15ワーム。 <ol><li>プリオンドメイントランスジェニックおよびWTワームのための別々の溶液を作る。必要なM9 +ワーム溶液の最終体積は、RNAiコピープレート（下記参照）に加え〜自動化ディスペンサーが使用される場合、リザーバ内に残るデッドボリュームを30mlの数に依存する。 </li></ol></li><li>細菌のdsRNA生産の3時間の誘導後、培養器の外板を取り、動物にストレスを熱を避けるために、RT（〜30分）にそれらを冷ます。 </li><li> 50μlのM9 +プリオンドメインジェニックワームのRNAiプレートの各ウェルに溶液および空ベクター対照プレートのいずれかを分配する。作る動物は貯水池の底に沈降する傾向があるので、各ステップの前にワームの溶液を混合するようにしてください。 </li><li>第二制御板へのWTワームを分注する。通気を可能にするために開封プレートのままにしておきます。一緒に5皿や湿ったペーパータオルとアルミホイルで包む - 蒸発する液体培養を維持するには、4スタック。 4日間、20℃、200rpmでインキュベートする。 </li></ol></li><li>得点 注：インキュベーターで4日後、ワームは、成人期の二日目にも、画面の準備ができています。動物が邪魔されずにスラッシングを確実にするためにスクリーニングする前に30分間ノン揺れ条件に合わせて調整しましょう​​。 <ol><li>対照処置プリオンドメイントランスジェニック動物と比較して増加したスラッシングを目視でモニターとコンピュータに接続されたファルコン4M60カメラを用いて、スクリーン。 </li><li> wrMTrck（次のセクションを参照）を使用して確認するために、予備的ヒットのリストをコンパイルします。 </li></ol></li></ol>予備の4.確認画面のヒット<ol><li>固体プレート上の運動アッセイ<ol><li>標準的な方法47に従って、アンピシリン100μg/ ml、12.5 / mlのテトラサイクリンおよび1mM IPTGを補ったNGMでプレートを準備します。可能な場合は、より合理映像取得プロセスを可能にするメディアの同じ高さを、持っているすべてのプレートを確実にするために、板注ぐマシンを使用しています。 </li><li> 37℃、250 rpmで〜1ミリリットルのLB +アンピシリン50μg/ ml、O / Nで異なるRNAiのクローンを育てる。 </li><li>次の日、3時間、1mMのIPTGでdsRNAの発現を誘導する。薄い層に広げ、それぞれのRNAi細菌クローン150μlでプレートをシード。暗闇の中で室温で2日間乾燥細菌をしてみましょう。 RNAiのクローン当たり3プレートを準備します。 </li><li>標準的な方法50（セクション1.2を参照）に応じて漂白することによりワームの人口を同期して、M9培地中で卵が孵化O / Nを聞かせて。 </li><li>ワーム懸濁液のサンプルを取り、NEMの量を決定する実体顕微鏡で1μl当たりatodes。 30のL1ワーム - それは25を含むように続いて、各実験プレートにM9プラスワームの適切な量をピペット。ワームは成人期の2日目に達するまで4日間、20℃で線虫を成長させる。 </li></ol></li><li> ImageJのためのwrMTrckのプラグインとのワ​​ームの運動性の定量分析 注：ビデオは浜松オルカ-R2デジタルカメラC10600-10Bと浜松シンプルPCIイメージングソフトウェアと10倍の倍率で立体顕微鏡を用いて記録した。 <ol><li>カメラとシンプルなPCIイメージングソフトウェアをオンにします。画像形成条件の調整を可能にする「ライブ」をクリックする。 </li><li>次のようにビデオ条件を設定します。ゲイン= 0;ハイライトモード=;高速インデックス= 1;ビニング= 2.「自動公開」した後、顕微鏡鏡と明るさとコントラストダイヤルを動かし、照明条件を調整します。 NOTE：ビデオoverexpことなく、高いコントラストを有する必要がある動物は明るい背景に黒い図形として表示されるように、osed。 </li><li> 「リアルタイム検索」をクリックし、フォルダとファイル名を選択します。 30秒20ミリ秒と「時の停止」に「フィールド遅延」に設定します。 （ほとんどのワームがどこにあるか）を記録する板の面積を選択するために押して「ライブレビュー &quot;。ステージ上でプレートを3または4回タップして、すぐに「開始」ビューとプレスの分野での地位を確認する。 </li><li>映画は記録を終了した後、画像の上で右クリックして、.AVIに.cxd形式からムービーを書き出すために「エクスポートモンタージュシーケンス」を選択します。 </li></ol></li><li>運動性のビデオを分析する<ol><li> ImageJソフトウェアを開き、「プラグイン」タブに移動し、その後「wrmtrck」と選択して &quot;wrMTrckバッチ」。分析対象のすべてのファイルを含むディレクトリを選択します。 </li><li> FIGURで詳述するようにwrMTrck_Batchの主入力ウィンドウでは、入力値をロードE 5C。各パラメータの説明は、プラグインに付属の説明書に記載されています。 「OK」をクリックし、運動解析の実行をしてみましょう。 </li><li>結果をキュレーションし、検出されたすべてのトラックが実際のCからであることを確認するエレガンスと、アーチファクトを排除する各ムービーの作成​​.txtファイルのそれぞれを開き、データ解析ソフトウェアファイルに情報をコピーする。手動で偽のワームのトラックをチェックし、排除するために作成された「* _labels.zip」ファイルを開き、得られた「* _labels.tif &quot;を実行。 </li></ol></li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

ここに記載されている方法は、拡散とプリオン様タンパク質の複雑な細胞自律的かつ非細胞自律的毒性を説明するのに役立つ。我々は最近、凝集しやすいサイトゾルプリオンドメインはオートファジー関連プロセスでの膜結合小胞に取り込まれることを発見した。これらの小胞の特定のサブセット内および細胞及び組織40との間のプリオンドメインを輸送する。生きている動物に彼ら...

アルツハイマー病（AD）、パーキンソン病（PD）、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、および伝染性海綿状脳症（TSE）を含む多くの神経変性疾患は、凝集しやすいタンパク質と会合している、したがって、集合的にタンパク質の誤った折りたたみに起因する疾患（PMDのとして知られている）。それらはヒトおよび動物の両方1に感染することができるという点でのTSEまたはプリオン病は、PMDののユニークなクラスを構成する。分子レベルでは、プリオンは募集および病理学的βシートが豊富なPrP Scの高次構造2,3に単量体のαヘリックスが豊富なホストでエンコードされた細胞のプリオン（PRP C）を変換することによって複製する。自己増殖タンパク質凝集体は、哺乳動物のプリオン4,5との重要な特徴を共有する真菌、で同定されている。さらに、哺乳類プリオンは細胞間の移動が可能であり、ナイーブ細胞6,7-感染する。 のPMD OTHながらERのTSEが感染性はないよりも、彼らは、プリオン病8,9と共通の病原性の原則を共有しています。のPMDのそれぞれにリンクされたタンパク質は、構造または機能に関連していないが、これらは結晶化のようなプロセスを経由してすべてのフォームの凝集体は核と呼ばれるまたは重合を播種。さらに、タンパク質性種子はそれらの可溶性アイソ2,10,11を補充することによって成長する。自己増殖に効率が一緒にそのような分子シャペロンなどの追加の細胞因子と最終的に集計核、播種、断片化および12〜15の拡散率を決定するタンパク質の固有の特性に応じて、 生体内で変化する。したがって、タンパク質凝集を効率的に伝播することができ、これらの要素の間で微妙なバランスが存在しなければならない。唯一のいくつかのアミロイド形成凝集体はプリオンの特性を保有するため、すべてのPMDが感染性ではない理由も説明するかもしれない。プリオンは、「トップパフォーマー &#39;Oを表しているようだそれらのPMD 8,13を研究するための強力なツールになり自己複製タンパク性凝集体のFA広いスペクトル、。 興味深いことに、疾患関連凝集に関連する毒性は、多くの場合、非細胞自律的な構成要素16,17を持っています。これは、厳密にのみ細胞が遺伝子を示すの特定の表現型を発現することを意味している自律的な効果を、細胞とは対照的に、対応する遺伝子を発現しない隣接細胞に影響を与えることを意味する。これは説得力組織特異的発現によって実証または神経変性疾患18-26の多数のモデルにおけるそれぞれのタンパク質のノックダウンした。様々なメカニズムが減少した栄養供給、ニューロンのシグナル伝達における不均衡、グルタミン酸興奮毒性、および神経炎症16,27,28を含むのPMDで、この非細胞自律的毒性、の基礎として提案されている。また、セル間の疾患関連プリオン凝集体のような動きは、mighTこの側面29,30に貢献する。増加する証拠は、プリオン以外のタンパク質含有物特性は、多くのPMD 30-36で観察病理の広がりを説明し得る、細胞間で伝達することができることを示唆している。しかし、まだ疾患タンパク質の細胞間移行及び隣接セルに対する毒性効果の間に明確な因果関係が存在するか否かを決定されなければならない。したがって、細胞間の伝送と非細胞自律的な毒性の根底にある細胞経路のより良い理解は、新規治療薬の開発のために必要不可欠である。しかし、後生動物において、ミスフォールドタンパク質の細胞から細胞への伝達に影響を広げ、細胞因子プリオン様の多くの側面はよく生物レベルで、特に理解されていない。 線虫（Caenorhabditis elegans）線虫は、電位を提供するいくつかの利点を有する プリオン様spreadiの新しい面を発見後生17 ngの。これは、in vivoで生体内の蛍光タグ化タンパク質の追跡を可能にする、透明である。さらに、病気の影響を受け、多くの細胞および生理学的プロセスは、人間のワームから保存されており、C.されている虫も遺伝子操作および分子および生化学的解析37-39幅広い種類のに適している。正確には959体細胞はまだ筋肉、神経細胞および腸を含む、いくつかの異なる組織タイプがあり、シンプルなボディプランに大人の雌雄同体を構成している。 C.の新しいプリオンモデルを確立するために、 虫は、我々はワーム4,40には知られている内因性プリオンタンパク質が存在しないので、外因的に、よく特徴付けグルタミン/アスパラギン（Q / N）細胞質の酵母プリオンタンパク質Sup35のリッチプリオンドメインNMを表現することにしました。酵母プリオンはプリオン複製41-44の基本的なメカニズムの解明に貴重だった。さらに、NMはモミです哺乳動物細胞培養45,46におけるプリオンの完全なライフサイクルを再現することが示されている第サイトゾルプリオン様タンパク質。同様に、Cで発現した場合虫は 、Sup35プリオンドメインは、酵母細胞と比較して、後生動物細胞内での増殖のためのさまざまな要件に非常によく採用され、プリオン生物学40の主要な機能を示した。NM凝集は、ミトコンドリアの完全性の破壊との外観を含め、深遠な有毒な表現型と関連していた細胞レベルで、様々なオートファジー関連小胞、ならびに胚および幼虫停止、発達遅延、および生物レベルでのタンパク質の折り畳み環境の広範な乱れ。驚くべきことに、プリオンドメインは、導入遺伝子が発現していないもので、隣接組織に影響を与え、細胞自律的かつ非細胞自律的な毒性を示す。さらに、内および細胞間のプリオンドメインの小胞輸送をリアルタイムに監視される&lt;em&gt;の生体内40で。 ここでは、Cのプリオンのような普及を検査する方法を説明します虫 。私たちは、タイムラプス蛍光顕微鏡を用いてプリオンドメインを含む小胞の細胞内および細胞間輸送を監視する方法について説明します。私たちは、組織特異的な折り畳み式センサの使用を強調し、普遍的に細胞のフィットネス上の細胞自律的かつ非細胞自律的な効果を評価するためのストレスレポーターを表現します。最後に、プリオン誘発毒性の新たな変性剤を同定するために最近行われたゲノムワイドRNA干渉（RNAi）は、画面の手順を説明する。組み合わせて、これらの方法は、タンパク質の細胞間移行及びそれらの非細胞自律的な毒性に関与する遺伝的経路を離れていじめるのを助けることができる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="665">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Reagent</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Nanosphere size standards 100 nm</td>
			<td style="width:107px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:92px;">3100A</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Levamisole</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:92px;">L-9756</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">IPTG</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:92px;">15502-10G</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:211px;">Ahringer RNAi library</td>
			<td style="width:107px;">Source BioScience LifeSciences&#160;</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.lifesciences.sourcebioscience 
			.com/clone-products/non-mammalian/c-elegans/c-elegans-rnai-library/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Equipment</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:211px;">Sorvall Legend XTR Refrigerated Centrifuge, 120VAC</td>
			<td style="width:107px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:92px;">75004521</td>
			<td style="width:255px;">http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_ 
			XTR_Refrigerated_Centrifuge_120 
			VAC/EW-17707-60</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">96 pin replicator&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Scionomix&#160;&#160;</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">HiGro high-capacity, incubating shaker&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Digilab</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.digilabglobal.com/higro</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">Multidrop Combi Reagent Dispenser&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Titertrek</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">Biomek FX AP96 Automated Workstation&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:211px;">Innova44 shaker</td>
			<td style="width:107px;">New Brunswick</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&#38;pb=d78efbc05310ec 
			04&#38;action=products&#38;contentid=1&#38; 
			catalognode=83389</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:211px;">M205 FA&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Leica</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:211px;">ORCA-R2 C10600-10BDigital CCD camera</td>
			<td style="width:107px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:211px;">Spinning Disc AF Confocal Microscope&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Leica</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:211px;">Falcon 4M60 camera&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Teledyne Dalsa&#160;</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Software</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:211px;">MetaMorph Microscopy Automation &#38; Image Analysis Software</td>
			<td style="width:107px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">Hamamatsu SimplePCI Image Analysis Software</td>
			<td style="width:107px;">Meyer Instruments</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">ImageJ</td>
			<td style="width:107px;">NIH</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">wrMTrck plugin for ImageJ</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">C. elegans strains</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:211px;">N2 (WT)</td>
			<td style="width:107px;">Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">AM815&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp]</td>
			<td style="width:107px;">Morimoto lab</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">available from our laboratory&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">See table 1 for a source for folding sensor and stress reporter strains</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism c. elegans

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer&#8217;s disease (AD), Parkinson&#8217;s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

in vivoでのタイムラプスイメージングによるプリオン様タンパク質の広がり間のモニタリング トランスジェニックC.プリオンドメインを発現する線虫株は、例えば 、細胞から細胞への伝達および非細胞自律的な毒性、プリオン様タンパク質の特定の側面を分析するために特に適している。動物の透明性は、蛍光人生のあらゆる段階?...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans at JoVE.com

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

拡散とプリオン様タンパク質の毒性は後生動物モデル生物を用いて調査<em&gt; C。エレガンス</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

investigating-spreading-toxicity-prion-like-proteins-using-metazoan

Research

JoVE Journal

Biology

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

15.7K ビュー.  Northwestern University. Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

ビデオ: Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

マイクロインジェクションを使用して安定したトランスジェニック線虫の世代

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

生物学

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale. This complex process requires the coordinated activity of many pre- and post-synaptic proteins to ensure appropriate synaptic connectivity, conduction of electrical signals, targeting and priming of secretory vesicles, calcium sensing, vesicle fusion, localization and function of postsynaptic receptors and finally, recycling mechanisms. As neuroscientists it is our goal to elucidate which proteins function in each of these steps and understand their mechanisms of action. Electrophysiological recordings from synapses provide a quantifiable read out of the underlying electrical events that occur during synaptic transmission. By combining this technique with the powerful array of molecular and genetic tools available to manipulate synaptic proteins in C. elegans, we can analyze the resulting functional changes in synaptic transmission. 
The C. elegans NMJs formed between motor neurons and body wall muscles control locomotion, therefore, mutants with uncoordinated locomotory phenotypes (known as unc s) often perturb synaptic transmission at these synapses 1. Since unc mutants are maintained on a rich supply of a bacterial food source, they remain viable as long as they retain some pharyngeal pumping ability to ingest food. This, together with the fact that C. elegans exist as hermaphrodites, allows them to pass on mutant progeny without the need for elaborate mating behaviors. These attributes, coupled with our recent ability to record from the worms NMJs 2,3,7 make this an excellent model organism in which to address precisely how unc mutants impact neurotransmission. 
The dissection method involves immobilizing adult worms using a cyanoacrylic glue in order to make an incision in the worm cuticle exposing the NMJs. Since C. elegans adults are only 1 mm in length the dissection is performed with the use of a dissecting microscope and requires excellent hand-eye coordination. NMJ recordings are made by whole-cell voltage clamping individual body wall muscle cells and neurotransmitter release can be evoked using a variety of stimulation protocols including electrical stimulation, light-activated channel-rhodopsin-mediated depolarization 4 and hyperosmotic saline, all of which will be briefly described.

Application of electrophysiology to accessible synapses provides a quantifiable measure of synaptic activity, useful in analyzing synaptic mutants. This article describes a dissection method used to expose the neuromuscular junctions (NMJ) of Caenorhabditis elegans (C. elegans) and briefly discusses some of the uses to which this preparation can be applied.

解離性とC. elegansの神経筋接合部から録音する

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

の生産 C.エレガンス</emとRecombineering経由>トランスジーン galK選択可能なマーカー

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, normal development or changes in environmental conditions2-5. Understanding the cellular signaling pathways that are involved in the response to hypoxia could provide new insight into treatment strategies for diverse human pathologies, from stroke to cancer. This goal has been impeded, at least in part, by technical difficulties associated with controlled hypoxic exposure in genetically amenable model organisms.
The nematode Caenorhabditis elegans is ideally suited as a model organism for the study of hypoxic response, as it is easy to culture and genetically manipulate. Moreover, it is possible to study cellular responses to specific hypoxic O2 concentrations without confounding effects since C. elegans obtain O2 (and other gasses) by diffusion, as opposed to a facilitated respiratory system6. Factors known to be involved in the response to hypoxia are conserved in C. elegans. The actual response to hypoxia depends on the specific concentration of O2 that is available. In C. elegans, exposure to moderate hypoxia elicits a transcriptional response mediated largely by hif-1, the highly-conserved hypoxia-inducible transcription factor6-9. C .elegans embryos require hif-1 to survive in 5,000-20,000 ppm O27,10. Hypoxia is a general term for "less than normal O2". Normoxia (normal O2) can also be difficult to define. We generally consider room air, which is 210,000 ppm O2 to be normoxia. However, it has been shown that C. elegans has a behavioral preference for O2 concentrations from 5-12% (50,000-120,000 ppm O2)11. In larvae and adults, hif-1 acts to prevent hypoxia-induced diapause in 5,000 ppm O212. However, hif-1 does not play a role in the response to lower concentrations of O2 (anoxia, operational definition &lt;10 ppm O2)13. In anoxia, C. elegans enters into a reversible state of suspended animation in which all microscopically observable activity ceases10. The fact that different physiological responses occur in different conditions highlights the importance of having experimental control over the hypoxic concentration of O2.
Here, we present a method for the construction and implementation of environmental chambers that produce reliable and reproducible hypoxic conditions with defined concentrations of O2. The continual flow method ensures rapid equilibration of the chamber and increases the stability of the system. Additionally, the transparency and accessibility of the chambers allow for direct visualization of animals being exposed to hypoxia. We further demonstrate an effective method of harvesting C. elegans samples rapidly after exposure to hypoxia, which is necessary to observe many of the rapidly-reversed changes that occur in hypoxia10,14. This method provides a basic foundation that can be easily modified for individual laboratory needs, including different model systems and a variety of gasses.

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

This paper details how to use continuous-flow hypoxia chambers to generate atmospheres with defined concentrations of O2 to understand biological responses to decreased O2. This system is easy to setup and maintain, and flexible enough to suit a wide range of O2 concentrations and model systems

に低酸素の影響を検討するために定義され気体環境を作成する<em&gt; C.エレガンス</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

線虫における身体サイズ調節に関与する遺伝子をスクリーニングするための戦略を給餌RNA媒介干渉を用いた<em&gt; Cエレガンス</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

抗体染色中<em&gt; C.虫</em&gt;「フリーズクラッキング」使用

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

上の細菌の影響を測定する<em&gt; C.エレガンス</em卵保持アッセイを用いて&gt;行動

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

における虚血/再灌流のための無酸素飢餓モデル<em&gt; C.虫</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis (diguanylate cyclases) and degradation (phosphodiesterases) of the second messenger c-di-GMP. In contrast, little information is available regarding the molecular mechanisms and cellular components through which this signaling molecule regulates a diverse range of cellular processes. Most of the known effector proteins belong to the PilZ family or are degenerated diguanylate cyclases or phosphodiesterases that have given up on catalysis and have adopted effector function. Thus, to better define the cellular c-di-GMP network in a wide range of bacteria experimental methods are required to identify and validate novel effectors for which reliable in silico predictions fail.
We have recently developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS) based technology as a powerful tool to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins. This technique has previously been reported to be applicable to a wide range of organisms1. Here we give a detailed description of the protocol that we utilize to probe such signaling components. As an example, we use Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic pathogen in which c-di-GMP plays a critical role in virulence and biofilm control. CCMS identified 74% (38/51) of the known or predicted components of the c-di-GMP network. This study explains the CCMS procedure in detail, and establishes it as a powerful and versatile tool to identify novel components involved in small molecule signaling.

The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.