細胞内で複製する微生物病原体は、最終的に感染した細胞から出て行かなければならない。これは、宿主病原体相互作用の他の局面と比較すると、比較的研究が行われている。ここでは、病原体流出を解析する手法について述べている。
我々は、比較的単純なアッセイを使用して流出効率を評価するか、またはポスト・エフラックス病原体を特徴付けることができる方法を示す ここで説明する一般的な技術は広く適用可能であるが、特定の病原体宿主細胞モデルは運動、用量、およびおそらく読み出しで異なる可能性がある。実験システムの設定と同様に、実験サンプルやコホートで本物の生物学的プロセスが確実に観察されるように明確な制御が確立することが不可欠です。手順を実証するのは、私の研究室の大学院生であるペトリア・ゲイルです。
感染実験から始めるには、ピペットを使用して、準備したてのLm接種物の20マイクロリットルを井戸に加え、皿をわずかに傾け、ピペットチップを慎重に上の媒体に入れます。ピペットチップで井戸の壁に触れないようにしてください。完全な混合を確実にするために、各ウェルの内容物を穏やかにピペット。
ウェルの壁にLMを広がらないように、プレートを揺らすか、または大幅に傾けないでください。細胞培養皿を摂氏37度、5%の二酸化炭素インキュベーターに戻す。希釈剤として未感染細胞からのコンディションされた培地を使用して、1ミリリットルのゲンタマイシン溶液あたり10マイクログラムを調製する。
感染後30分で、1ミリリットル当たり2ポイント5マイクログラムの最終濃度に達するために、30マイクロリットルのゲンタマイシン溶液を皿に慎重に加える。ウェルの内容物を軽くピペットし、培養皿を培養液に還元します。収穫するには、皿を少し傾け、慎重に井戸からメディア全体を取り除くためにピペットを使用しています。
蒸留された無菌水のポイント5ミリリットルを井戸に加えます。30秒後、得られた水を1ポイント5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移し、渦を10秒間激しく移動させます。4ポイント5マイクロリットルと50マイクロリットルの水溶出液を450マイクロリットルの蒸留された無菌水に加え、10倍および100倍の希釈液を調製します。
徹底的な混合を確実にするために簡単に渦。元の10倍希釈したサンプルと100倍希釈したサンプルをリソゲニーブロス寒天プレートに50マイクロリットル加え、プレートスプレッダーを使用して広げます。新興LMのアッセイのために、皿から重ね合う媒体の10マイクロリットルを抽出し、2つの5マイクロリットルのアリコートおよびマイクロ遠心分離管に分ける。
DMEM/FCSの5マイクロリットルを1つのアリコートに加え、ミリリットルゲンタマイシンあたり5マイクロリットルを含むDMEM/FCSの5マイクロリットルをコントロールとして2番目のアリコートに加えます。室温で5分待ちます。各アリコートに90マイクロリットルの蒸留無菌水を加え、2つを10秒間激しく渦液化します。
LB寒天プレートにサンプル50マイクロリットルを加え、プレートスプレッダーを使用して広げます。Lmコロニーを列挙する前に、プレートを摂氏37度のインキュベーターで2日間保存します。自動セルカウンターを使用して、調製された生の2-6-4ポイント7細胞を10倍から6番目の細胞/ミリリットルの濃度に調整します。
6ウェル組織培養プレートの井戸にサンプル1ミリリットルを加えます。50の感染の多重度に対応して、調製されたLm接種で細胞を感染させる。感染後1ポイント5時間で、PFA4%の500マイクロリットルで満たされた1点5ミリリットルマイクロ遠心チューブで、井戸の最初のセットから培地を収集し、チューブを氷の上に置く。
細胞内Lmを収集するには、各井戸に蒸留された無菌水を1ミリリットル加えます。60秒後、得られた水のライセートを、4%PFAの500マイクロリットルの1ポイント5ミリリットルマイクロ遠心分離管に移します。チューブを10秒間激しく渦を出し、氷の上に置きます。
残りの井戸の場合は、培地を取り除き、1ミリリットルのDMEM/FCSを5マイクログラム/ミリリットルのジェンタマイシンで交換して細胞外Lmを殺します。30分後、メディアを取り外し、ゲンタマイシンなしでDMEM/FCSに交換してください。さらに2時間と4時間後、2回目と3回目のポイントをチューブにライセートしてメディアを収集し、氷の上に置いて冷やします。
遠心管は10,000倍Gで7分間用いた。ピペットを使用して、ペレットを邪魔することなく上清を除去する。4%PFAの50マイクロリットルと15マイクロリットルのファロイジンを含む染色カクテルをチューブに加え、混合して各ペレットを懸濁します。
暗闇の中でチューブを摂氏4度で20分間インキュベートします。インキュベーションの後、各チューブにFACSバッファーの1ミリリットルを加え、ピペットを上下に加えて混合します。遠心分離機のスピンチューブを10,000倍Gで7分間回転させる。
ペレットを邪魔することなく上清を除去します。すぐに使用するには、各ペレットを400マイクロリットルのFAXバッファにサスペンドします。後で分析するために保管する場合は、200マイクロリットルのFAXバッファと4%PFAの200マイクロリットルをチューブに加え、混合して中断します。
抗生物質ジェンタマイシンによる短時間治療における感染条件を使用して非内在Lmを排除し、野生型Lmのゼロポイント-1-5%は、培養マクロファージとの共培養の1ポイント-5時間後に回収される。その後の共培養では、細胞内増殖のみを表す実行可能なLmの回収率が4倍、7ポイントの5倍の増加があった。初期感染時に過大性のprfAを有するLm株に対して同等のプロファイルが観察されたが、3〜6回のHPIの間では観察されなかった。
prfAがLm株から削除されたとき、長期の共培養後の歪みの回収に続く減少がある。ゲンタマイシンが6つのHPIでウェルから取り除かれると、細胞外Lmは野生型および過毒性のprfA株の両方について1時間後に検出することができるが、prfAを有する株は削除されない。感染していないマクロファージと感染したマクロファージの両方を重ねたメディアには、光散乱、細菌サイズの粒子状物質が含まれていました。
しかし、感染したマクロファージからの培地のみが、サイズの格言内にGFP陽性信号を有していた。フェロイジン陽性Lmの出現の時間依存性の増加は、感染したマクロファージで観察された。48ウェル組織培養皿でマクロファージをめっきする場合は、細胞なしでいくつかの井戸を残します。
これらの非細胞制御井戸は、病原体、抗生物質などを加えて細胞含有ウェルとまったく同じように処理され、実験シグナルが宿主細胞の存在に依存することを保証する。図1および3に示す実験と同様に、病原体または宿主因子およびまたは小分子は、病原体細胞流出に対する影響について試験することができる。
