يجب على مسببات الأمراض الميكروبية التي تتكاثر داخل الخلايا في نهاية المطاف الخروج من الخلية المصابة. الذي، بالمقارنة مع جوانب أخرى من التفاعلات الممرض المضيفة هو أقل نسبيا من دراسة. هنا، نحن وصف تقنيات لتحليل ايفلوليكس المسببة للأمراض.
نظهر كيف يمكن استخدام المقايسات ببساطة نسبيًا لتقييم كفاءة efflux أو توصيف مسببات الأمراض اللاحقة لـ efflux ، التقنيات العامة الموصوفة هنا قابلة للتطبيق على نطاق واسع على الرغم من أن نماذج محددة من الخلايا المضيفة المسببة للأمراض قد تختلف في الحركة والجرعات وربما القراءة. وكما هو الحال في إنشاء أي نظام تجريبي، من الضروري وضع ضوابط واضحة تكفل رصد العمليات البيولوجية الحقيقية في العينات أو الأفواج التجريبية. إثبات الإجراء سيكون (بيتريا غايل) طالبة دراسات عليا من مختبري
لتبدأ تجربة العدوى، واستخدام ماصة لإضافة 20 ميكرولترات من lm a inoculum الطازجة إلى الآبار، مع الطبق يميل قليلا وتلميح ماصات وضعت بعناية في وسائل الإعلام overlying. تجنب لمس جدران البئر مع طرف الماصات. ماصات بلطف محتويات كل بئر لضمان الاختلاط الكامل.
لا تهز أو إمالة كبيرة لوحة لتجنب انتشار LM على جدران البئر. إعادة طبق ثقافة الخلية إلى 37 درجة مئوية، خمسة في المئة حاضنة ثاني أكسيد الكربون. استخدام وسائل الإعلام مكيفة من الخلايا غير المصابة كما diluent لإعداد 10 ميكروغرام في حل جنتاميسين المليلتر.
في 30 دقيقة بعد العدوى، إضافة بعناية 30 ميكرولترات من الحل gentamicin في الطبق للوصول إلى تركيز النهائي من اثنين من نقطة خمس ميكروغرام لكل ملليلتر. الماصات بلطف محتويات البئر لخلط وإعادة طبق ثقافة الخلية إلى الحاضنة. للحصاد، إمالة قليلا الطبق واستخدام دقيق بعناية لإزالة وسائل الإعلام بأكملها من البئر.
أضف نقطة-خمسة ملليلتر من الماء المقطر والمعقم إلى البئر. بعد 30 ثانية، نقل الماء الناتج إلى نقطة واحدة خمس ملليلتر microcentrifuge أنبوب ودوامة بقوة لمدة 10 ثانية. إضافة أربع نقاط خمس ميكرولترات و 50 ميكرولترات من lysate المياه إلى 450 ميكرولتر من الماء المقطر، المعقمة لإعداد التخفيفات عشرة أضعاف ومائة ضعف.
دوامة لفترة وجيزة لضمان خلط شامل. إضافة 50 ميكروليتر من العينات المخففة عشرة أضعاف الأصلي ومئتي مرة المخفف على لوحات مرق lysogeny أجار، وانتشار باستخدام موزع لوحة. إلى مقايسة لLM الناشئة، واستخراج 10 ميكرولترات من وسائل الإعلام تراكب من الطبق وتقسيمه إلى اثنين من اسكوت عن اليرقة خمسة ميكرولتر وأنابيب أجهزة الطرد المركزي الصغيرة.
إضافة خمسة microliters من DMEM / FCS إلى aliquot واحد وإضافة خمسة microliters من DMEM / FCS تحتوي على خمسة microliters لكل المليلتر gentamicin إلى aliquot الثانية كتحكم. انتظر خمس دقائق عند درجة حرارة الغرفة. إضافة 90 ميكرولترات من الماء المقطر المعقم إلى كل aliquot ودوامة اثنين بقوة لمدة 10 ثانية.
ثم إضافة 50 ميكروليتر من العينة على لوحات أجار LB وانتشار باستخدام موزع لوحة. تخزين لوحات في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة يومين قبل تعداد المستعمرات لام. باستخدام عداد الخلايا الآلي، ضبط المعدة، الخام اثنين من ست أربع نقاط-سبع الخلايا إلى تركيز واحد مرات 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر.
إضافة ملليلتر واحد من العينة إلى آبار من ستة بئر النسيج لوحة الثقافة. تصيب الخلايا مع inoculum Lm المعدة، المقابلة لتعدد العدوى من 50. في نقطة واحدة خمس ساعات بعد العدوى، في أنبوب microcentuge نقطة واحدة خمس ملليلتر مليئة 500 ميكرولترات من أربعة في المئة PFA، وجمع وسائل الإعلام من المجموعة الأولى من الآبار ووضع الأنبوب على الجليد.
لجمع Lm داخل الخلايا، أضف ملليلتر واحد من الماء المقطر والمعقم لكل بئر. بعد 60 ثانية، نقل المياه الناتجة إلى أنبوب ميكروسنتروج من نقطة واحدة خمس ملليلتر مع 500 ميكرولترات من أربعة في المئة PFA. دوامة الأنبوب بقوة لمدة 10 ثوان ووضعها على الجليد.
بالنسبة للآبار المتبقية، قم بإزالة الوسائط واستبدلها بميليلتر واحد من DMEM/FCS مع خمسة ميكروغرام لكل ملليلتر جنتاميسين لقتل Lm.فوراً خارج الخلية العودة الطبق إلى الحاضنة. بعد 30 دقيقة، وإزالة وسائل الإعلام واستبدال مع DMEM / FCS دون جنتاميسين. بعد آخر ساعتين وأربع ساعات، وجمع وسائل الإعلام في lysates لنقاط المرة الثانية والثالثة في الأنابيب ووضعها على الجليد للاسترخاء.
أنابيب الطرد المركزي في 10،000 مرة G لمدة سبع دقائق. باستخدام ماصة، وإزالة فائقة دون إزعاج بيليه. إضافة تلطيخ كوكتيل تحتوي على 50 ميكرولترات من أربعة في المئة PFA و 15 ميكرولترات من phalloidin في الأنبوب ومزيج لتعليق كل بيليه.
احتضان أنابيب في الظلام في أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. بعد الحضانة، إضافة ملليلتر واحد من عازلة FACS إلى كل أنبوب والماصة صعودا وهبوطا لخلط. أنابيب الدوران في جهاز الطرد المركزي في 10،000 مرة G لمدة سبع دقائق.
إزالة مُنَتَهَم دون إزعاج البيليه. للاستخدام الفوري، قم بتعليق كل بيليه في 400 ميكرولترات من المخزن المؤقت للفاكس. إذا تخزين لتحليلها في وقت لاحق، إضافة 200 ميكرولترات من المخزن المؤقت الفاكس و 200 ميكرولترات من أربعة في المئة PFA في أنبوب ومزيج لتعليق.
باستخدام حالات العدوى في العلاج القصير مع المضادات الحيوية gentamicin للقضاء على لام غير م internalized، صفر نقطة واحد إلى خمسة في المئة من lm من النوع البرية يتم استرداد بعد نقطة واحدة-خمس ساعات من الحضانة المشتركة مع الضامة مثقف. وفي الحضانة المشتركة اللاحقة، حدثت زيادة بمقدار أربعة أضعاف وسبع نقاط في استعادة Lm القابلة للحياة، التي تمثل حصراً الانتشار داخل الخلايا. ولوحظ وجود صورة مشابهة لسلالة Lm التي تمتلك prfA مفرطة الضراوة أثناء العدوى الأولية ولكن ليس بين ثلاثة وستة من HPI.
عندما تم حذف prfA من سلالة Lm ، هناك انخفاض لاحق في استرداد السلالة بعد فترة طويلة الحضانة المشتركة. عندما تتم إزالة gentamicin من الآبار في ستة HPI، يمكن الكشف عن Lm خارج الخلية ساعة واحدة في وقت لاحق لكل من سلالات prfA من النوع البري وفرط، ولكن ليس للسلالة مع prfA حذف. وسائل الإعلام التي تتراكب على كل من الضامة غير المصابة وغير المصابة تحتوي على جسيمات مبعثرة بالضوء بحجم البكتيريا.
ومع ذلك، فإن الوسائط فقط من الضامة المصابة تمتلك إشارات إيجابية من GFP داخل حجم البوابات. لوحظت زيادة تعتمد على الوقت في ظهور lm إيجابية phalloidin مع الضامة المصابة. عند طلاء خارج الضامة في طبق ثقافة الأنسجة 48-well، ترك بعض الآبار دون خلايا.
ثم يتم التعامل مع هذه الآبار التي لا تحتوي على خلايا بالضبط مثل الآبار المحتوية على الخلايا ، من حيث إضافة مسببات الأمراض ، والمضادات الحيوية ، وما إلى ذلك لضمان أن الإشارات التجريبية تعتمد على وجود الخلايا المضيفة. وعلى غرار التجارب المبينة في الشكلين الأول والثلاث، يمكن اختبار العوامل المسببة للأمراض أو العوامل المضيفة أو الجزيئات الصغيرة من حيث تأثيرها على الإفلوكس الخلوية المسببة للأمراض.
