我々は、新たに合成されたDNAのEdU標識とナノ金粒子の銀増強による標識検出およびクロマチンのChromEM染色による細胞内の複製ドメインの電子顕微鏡可視化のためのプロトコルを提示する。このプロトコルは、従来のグルタルアルデヒド固定による高コントラストのプレ包埋標識を提供し、室温サンプル処理のためのクロマチンの最良の構造保存を提供します。このプロトコルは、ペトリ皿のカバースリップ上で増殖する付着細胞に対して最適化されている。
最終濃度10マイクロモルにEdUを加え、所望の標識時間の間、細胞をインキュベーターに入れる。標識細胞を100ミリモルのカコジル酸ナトリウム溶液中の2.5%グルアラデヒド水で1時間固定する。固定時間が長くなると、EdU標識に悪影響を及ぼす可能性があります。
5ミリモルの塩化マグネシウムを添加したPBSで試料をすすぐことによってグルタルアルデヒドを除去し、さらにPBSスターとみなす。10分間3回洗う。PBSスター中のトリオーネX-100の1%溶液で原形質膜を透過処理し、それぞれ5分間2つの変更を行う。
この溶液はさらにPBSスターT.と呼ばれます.PBSスターでサンプルを広範囲に洗浄します。それぞれ 5 分間に 5 つの変更を行います。PBSスター中の20ミリモルのグリシンで残留アルデヒド基を、10分間2回クエンチする。
サンプルを1%BSAのPBSスターに30分間置きます。BSAでブロッキングしながら、EdU検出用の反応カクテルを準備する。成分添加の順序は重要です。
EdUビオチン - アジドコンジュゲーションは、反応カクテル内の蒸発および濃度シフトを最小限に抑えるために、湿潤チャンバ内で行われる。湿った部屋を準備します。細胞を上に向けてパラフィルム上にカバースリップを置き、50〜100マイクロリットルの反応カクテルをカバースリップ上に重ねる。
反応は室温で30分かかる。試料をPBSスターTで洗浄して反応を停止し、それぞれ5分間を5回行った。PBSスターTの1%BSAでさらに30分間ブロックします。
ストレプトアビジン-ナノゴールド溶液をPBSスターTに1%BSAで調製する。サンプルをストレプトアビジンと共に、新しく調製した湿ったチャンバー内でプラス4度で一晩インキュベートする。手順は、EdUビオチン - アジドコンジュゲーションと同じである。
反応を停止し、試料を洗浄し、PBSスターT.T安定化ビオチンストレプトアビジン複合体をPBSスターでそれぞれ10分間5回、30分間、PBSスターの1%グルタルアルデヒドで安定化させる。脱イオン水で激しく洗浄してグルタルアルデヒドを除去する。残留アルデヒド基を水素化ホウ素ナトリウム1ミリリットルあたり1ミリグラムでクエンチする。
もう一度よく洗ってください。次のステップは、ゴールデンコース上の銀堆積によってナノゴールド粒子のサイズを増加させることである。暗室の活動を最小限に抑えるためにプレミックスを準備します。
洗浄バッファーでサンプルを平衡化し、暗室に進みます。暗室で成分を混合して洗浄液を調製し、それをサンプルに塗布する。アカシア粉末溶液は、非常に視認性が高い。
したがって、成分を混合している間は、気泡や泡の形成を避けるためにチューブをゆっくりと揺らしてください。反応には2〜5分かかります。最適な反応時間を決定するためにテストランを実行することをお勧めします。
より長いインキュベーション時間は、不特定の銀沈着をもたらし得る。反応を止めるには、3~5種類のイオン交換水を入れてサンプルを素早くすすいでください。その後、それぞれ5分間、さらに3つの変更が行われました。
四酸化オスミウムによる溶解から銀ナノ粒子を保護するために、サンプルを0.05%テトラクロロ金酸中で暗所で2分間インキュベートする。イオン交換水で十分に洗ってください。この段階で、さらなるコントラストがDNA含有物質に付加される。
サンプルをDRAQ5 DNA染色で飽和させます。ジアミオノベンジジン溶液をサンプルに加え、1分間インキュベートする。カバースリップをガラス底のペトリ皿に移動し、倒立顕微鏡のステージに置きます。
640ナノメートルの赤色光で複数の視野を照射する。左パネルは、DRAQ5の完全な写真漂白を示しています。右側のパネルでは、DAB沈殿物を示す透過光で同じ視野が撮像されている。
脱イオン水でサンプルを洗浄します。次の段階はヒュームフードの下で行われるべきです。部分還元型四酸化オスミウム溶液を調製した。
注意してください。この物質は非常に揮発性で有毒です。調製した溶液を試料上に塗布する。
この段階では、還元されたオスミウム化合物はジアミオノベンジジン沈着と反応し、DNAのコントラストを増加させる。オスミウム含有溶液は、地域の規制に従って廃棄し、サンプルを3回、それぞれ5分間洗浄します。サンプルは、エタノール濃度を上昇させる一連の中でさらに脱水され、続いてエタノール樹脂混合物による細胞の浸潤が続く。
アルコールレジンミックスを新しく調製した純樹脂に置き換えます。適切なサイズの埋め込み型に、新しく調製した樹脂を充填します。セルを下に向けてカバースリップを樹脂で満たされたキャビティの上に置きます。
樹脂を37度で24時間硬化させる。その後、少なくとも2日間60度で。カバーの底面から樹脂を取り出します。
スラブを液体窒素に落とし、沸騰した水に移します。ガラスが外れる必要があります。必要に応じて繰り返します。
照射された視野は、ジアミオノベンジジン沈着およびDAB染色のためにはっきりと見えるべきである。弓のこぎりまたはその他の適切な器具を使用して、スラブから関心のある領域を切り取ります。切り欠きをウルトラミクロトームのシンプルホルダーに入れます。
最終的なブロックトリミング用にウルトラミクロトームを設定します。カミソリの刃を使って、ピラミッド型の枕を用意します。ピラミッドの上の平らな領域のサイズは、約400 x 200ミクロンでなければなりません。
準備したピラミッドをウルトラミクロトームアームに取り付け、ナイフを取り付けます。セクションを準備します。断面の厚さは、実験要件に合わせて調整できます。
EM断層撮影を目指しています。そこで、半薄切片とも呼ばれる厚さ250ナノメートルの切片を用意しました。ナイフの端からセクションを取り外し、スロットグリッドに取り付けます。
私たちはスロットグリッドを使用しました、彼らは周りにあるために丸い1ミリメートル、1ミリメートルの側面開口部でした。小さな開口部サイズは、セクションのより良い安定性を提供します。グリッド上でサンプルを乾燥させます。
この時点で、セクションは観測の準備ができています。グリッドを電子顕微鏡サンプルホルダーに入れます。試料を電子顕微鏡に装填する。
チルトシリーズを取得します。哺乳動物細胞核における複製病巣は、S期進行に応じて明確な分布パターンを示す。蛍光標識アジドとのクリック反応によって確認された成功したEdU標識は、上部にグルタルアルデヒド固定後の不均一な細胞集団における典型的な複製パターンを実証する。
ストレプトアビジン標識は、グルタルアルデヒドの影響を受け得る。そこでまず、底面のストレプトアビジンナノゴールドと同じ条件で蛍光ストレプトアビジン染色を確認する。銀増強手順の良好な結果は、底部に示されているいくつかの核の暗褐色染色および非常にかすんだ黄色のサイトプラスト染色である。
事前埋め込み標識の利点は、切片化のために細胞を選択する可能性である。この段階では、標識パターンが明視野顕微鏡下で見えるようになるため、可能です。適切なラベル付けにより、適切に区切られたレプリケーション サイトが作成されます。
矢印はクロマチン繊維を染色したDABを示す。右側のバックグラウンド標識は、1平方ミクロンあたり数個のナノ粒子に限定されています。半薄い切片は断層撮影の準備ができており、金ナノ粒子を添加する必要はありません。
複製が有効な部位におけるクロマチン組織の研究に使用される記載されたアプローチ。クロマチン分離の高解像度イメージングを含むクロマチンの複製後再配列の分析用。また、大きな染色体ドメインの複製標識や、高次クロマチンフォールディングおよびヘテロクロマチンの研究にも使用されます。
この画像化技術は、他の非顕微鏡的アプローチによって生成されるデータの基準点としても重要である。この方法は、超解像技術を含む相関顕微鏡研究にも適合させることができる。これは、細胞の様々な生理学的状態におけるクロマチン高次構造とそのダイナミクスの研究における新しい地平を開く。
