이 프로토콜은 골격 근육에서 미세 혈관 내피 세포를 분리하는 플랫폼 기술을 설명합니다. 이 세포는 혈액 근육 장벽 기능에 추가 통찰력을 얻기 위하여, 예를 들면, 이용될 수 있습니다. 기존 방법에 비해이 기술의 주요 장점은 높은 순도로 1 차적인 미세 혈관 내피 세포를 격리할 수 있다는 것입니다.
이 기술은 건강과 질병에 있는 근육과 내피 세포 사이 상호 작용과 같은 면역 매개 근육 질병의 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 첫째, 프로토콜에 설명된 대로 필요한 모든 솔루션과 6웰 플레이트를 준비합니다. 실용적인 절차를 시작하려면 외과 날카로운 / 무딘 가위, 수술 날카로운 / 날카로운 가위 한 쌍, 직선 및 곡선 집게 한 쌍을 가져옵니다.
70%에탄올로 모든 수술기구를 소독합니다. 안락사 성인 남성 마우스를 등에 놓고 다리를 70% 에탄올로 적시시습니다. 날카로운 / 무딘 수술 가위를 사용하여, 엉덩이 관절에서 절단하여 각 다리를 절단.
사지를 폐쇄된 세포 배양 접시에 놓습니다. 접시를 멸균 라미나르 플로우 후드로 옮겨주세요. 날카로운 가위와 구부러진 집게를 사용하여 엉덩이에서 발가락 끝까지 피부를 자른다.
구부러진 집게를 사용하여 발가락에서 엉덩이까지 피부를 벗겨내는 동안 발가락 또는 발 패드를 고정하기 위해 직선 집게를 사용합니다. 근육 사분면 페모리스를 분리하려면 무릎에서 힘줄을 자르고 대퇴골을 따라 근육을 엉덩이로 절단합니다. 아킬레스건을 세워 근육삼두근 수라를 분리한다.
다음으로, 경골을 따라 포틸라이트 포사로 자르고 근육을 제거합니다. 해리할 수 없는 힘줄을 제거하려면 구부러진 집게로 근육을 잡고 적절한 힘줄을 잘라냅니다. 준비된 소화 용액 2, 445 마이크로리터를 신선하고 라벨이 붙은 세포 배양 접시에 넣고 무게를 결정합니다.
이 요리에 근육 조각을 모두 전송합니다. 그런 다음 무게를 결정합니다. 측정된 두 값의 차이는 1그램을 초과해서는 안 되는 근육 조직의 건조 중량을 제공합니다.
외과 날카로운 가위를 사용하여 전체 근육 조직을 작은 조각으로 자른다. 1.5시간 동안 37°C의 티슈 서스펜션을 5%의 이산화탄소로 배양하여 서스펜션을 약 5분 동안 20분마다 1밀리리터 인슐린 주사기와 신중하게 혼합하십시오. 인큐베이션 후 서스펜션을 50밀리리터 라벨튜브에 배치된 70마이크로미터 나일론 스트레이너로 옮기고 흐름을 수집합니다.
DMEM의 8 밀리리터로 셀 스트레이너를 세척하고 흐름을 수집합니다. 조각이 스트레이너를 연결하는 경우 분리된 솔루션을 다시 일시 중지합니다. 셀 스트레이너를 버리고 서스펜션을 300배, 섭씨 20도에서 10분 동안 폐기하십시오.
상체를 조심스럽게 제거하고 적혈구의 용액에 대한 암모늄 염화 칼륨 분해 버퍼의 1 밀리리터에서 세포 펠릿을 다시 분리합니다. 실온에서 30초 동안 배양하세요. 그런 다음 10%의 FCS를 포함하는 DMEM의 9밀리리터를 추가하여 반응을 중지합니다.
세포 현탁액을 15 밀리리터 튜브로 옮기. 그런 다음 Neubauer 세포 계수 챔버를 사용하여 세포 수를 결정합니다. CD45 양성 세포를 고갈하기 시작하려면 서스펜션을 300배, 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리합니다.
상체를 완전히 제거하고 MCS 버퍼의 90 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 다시 분리하십시오. CD45 마이크로비드 10마이크로리터를 추가하고 서스펜션을 혼합합니다. 냉장고에 4~8도의 인큐베이션을 15분간 사용해 보임.
이 후 MCS 버퍼의 밀리리터 1밀리리터를 추가합니다. 원심분리기는 중력의 300배, 섭씨 4도에서 10분 동안. 상체를 완전히 제거하고 MCS 버퍼의 500 마이크로리터에서 셀을 다시 분리합니다.
분리기의 자기장에 큰 자기 컬럼을 배치합니다. MCS 버퍼의 세 밀리리터로 컬럼의 저장소를 헹노게 합니다. 그런 다음 컬럼 아래에 15밀리리터 원내 튜브를 배치하여 흐름을 수집합니다.
전체 셀 서스펜션을 열에 적용하고 완전히 흐르게 합니다. 각 세척 단계에 대해 MCS 버퍼 3밀리리터를 저장소에 추가하고 다음 세척 단계를 시작하기 전에 기둥의 저장소가 비어 있는 때까지 기다리면서 컬럼을 세 번 세척합니다. 추가 분리 단계에서 사용하기 위해 컬럼을 통과하는 레이블이 없는 셀을 수집합니다.
CD31 양성 세포를 축적하기 시작하려면 Neubauer 세포 계수 챔버를 사용하여 세포 수를 결정합니다. 그 후, 10 분 동안 300 배 중력과 섭씨 4도에서 라벨이 없는 세포를 원심 분리합니다. 상체를 완전히 제거하고 MCS 버퍼의 90 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 분리합니다.
CD31 마이크로비드 10마이크로리터를 추가하고 전체 서스펜션을 혼합합니다. 냉장고에 4~8도의 인큐베이션을 15분간 사용해 보임. 그 후, MCS 버퍼와 원심분리기의 밀리리터를 300배, 섭씨 4도에서 10분간 추가합니다.
상체를 제거하고 MCS 버퍼의 500 마이크로 리터에서 셀을 다시 일시 중지합니다. 분리기의 자기장에 중간 자기 열을 배치합니다. MCS 버퍼의 500 마이크로리터로 컬럼을 헹구는 다.
다음으로, 컬럼 아래에 15밀리리터 원내 튜브를 배치하여 흐름을 수집합니다. 전체 셀 서스펜션을 열에 적용하여 완전히 흐르게 합니다. 각 세척 단계에 대해 500 마이크로리터의 MCS 버퍼를 저장소에 추가하여 컬럼을 세 번 세척하고 다음 세척 단계를 시작하기 전에 기둥의 저장소가 비어 있습니다.
열을 전달하는 레이블이 지정되지 않은 셀은 CD45-음수, CD31-음수 분획을 나타냅니다. 추가 품질 관리를 위해 저장합니다. 그런 다음 분리기에서 컬럼을 제거하고 적절한 수집 튜브에 놓습니다.
파이펫 은 열에 MCS 버퍼의 두 밀리리터. 즉시 플런저를 컬럼으로 밀어 자석으로 표지된 세포를 플러시합니다. 이 CD45-음수, CD31 양성 분획은 농축된 기본 뮤린 IC를 나타냅니다.
원심 분리는 350 배 중력과 5 분 동안 섭씨 20도에서 세포 현탁액을 분리합니다. 상체를 완전히 제거하고 내피 세포 배지의 1 밀리리터에서 세포를 다시 분리합니다. 내피 세포 배지의 1 밀리리터를 포함하는 코팅된 6웰 배양판의 단일 웰로 세포를 이송한다.
재배를 위해 멸균 인큐베이터에 이산화탄소5%를 사용하여 섭씨 37도에서 세포를 배양하여 2~3일마다 배지를 새로 고치십시오. 세포가 80~90%의 합류에 있을 때, 두 번 연속 세척 단계에서 PBS의 2밀리리터로 세포를 두 번 함유하는 각 우물을 헹구는다. 그런 다음 800 마이크로리터의 트립신 EDTA 용액을 각 우물에 추가하고 37도에서 37도의 배양하고 멸균 인큐베이터에 이산화탄소를 5%로 배양합니다.
그 후, 효소 활성을 중지하기 위해 최소 10%의 FCS를 포함하는 DMEM의 1, 200 마이크로리터를 추가합니다. 원심분리기는 중력의 350배, 섭씨 20도에서 5분간. 이어서, 순도를 증가시키기 위해 이전에 설명된 바와 같이 CD31 세포를 축적한다.
20% 배율 및 0.35 렌즈 숫자 조리개와 함께 밝은 필드 또는 표준 상 계약 현미경을 사용하여 세포 결합을 관찰한다. 이 연구에서는, 1 차적인 뮤린 골격 근육 미생물 내피 세포는 고립된다. 고립 후 하루, 기본 뮤린 MMEC 및 잔류 다른 세포는 대기업을 형성하고 문화 요리의 바닥을 준수합니다.
7일부터 평평하고 길쭉한 세포가 관찰될 수 있지만, 다른 대부분 스페로이드 세포의 오염은 여전히 볼 수 있다. 따라서 MCS를 통한 CD31 양성 선택의 또 다른 주기가 필요합니다. 이하, 1차 뮤린 MMECs는 약 80~90%의 밀도로 증식하여, 종로정렬세포의 겹치지 않는 단층을 형성한다.
접촉 억제로 인해 인플루엔자에 대한 증식이 중단됩니다. 유동 세포측정을 통한 품질 관리는 격리 직후 세포에 대해 각각 약 70%에 이르는 생존력과 순도 에 대한 값을 보여줍니다. MCS를 통해 또 다른 CD31 양성 선택 후 재배된 세포는 순도뿐만 아니라 생존가능성에 대한 만족스러운 값을 보여주며, 각각 최대 95%에 이르는 것으로 나타났다.
얻어진 세포는 양적 PCR에 의하여 mRNA 수준에 있는 근육 위성 세포 마커 유전자의 유전자 발현을 위해 그 때 조사된다. 예상대로, CD45-음성, CD31-음성 분획뿐만 아니라 분화된 원발성 뮤린 근육 세포발현 박스 단백질 7 및 M-cadherin, CD45-네거티브, CD31 양성 및 1차 뮤린 MMEC는 이러한 마커에 대해 부정적이다. 제2 CD31 MCS 단계 후, qPCR은 컨쿼티 원골 뮤뇨 MMEC에서 단단한 접합 단백질의 발현을 평가하는 데 사용된다.
1차 뮤린 MMEC는 클라우디넨-5, 클로글딘, 조눌라 클로글렌스-1의 높은 수준을 표현하는 반면, pmMC는 조눌라 클로들렌스-1의 낮은 발현만 을 보여준다. 이 기술은 5~6시간 안에 수행될 수 있다. 이 프로토콜에 따라 마이그레이션 분석 또는 저전단 응력 실험과 같은 다른 방법을 수행하여 추가 질문에 답할 수 있습니다.
이 비디오를 시청 한 후, 당신은 역학 및 효소 해리 및 자기 세포 분류에 의해 골격 근육에서 기본 미세 혈관 내피 세포를 분리 할 수 있어야합니다.
