Este protocolo describe una técnica de plataforma para aislar las células endoteliales microvasculares de los músculos esqueléticos. Estas células se pueden utilizar, por ejemplo, para obtener más información sobre las funciones de barrera muscular en la sangre. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes es que es posible aislar células endoteliales microvasculares primarias con alta pureza.
Esta técnica puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las enfermedades musculares mediadas por el sistema inmunitario, como la interacción entre el músculo y las células endoteliales en la salud y la enfermedad. En primer lugar, prepare todas las soluciones necesarias y placas de seis pozos como se describe en el protocolo. Para comenzar el procedimiento práctico, obtenga un par de tijeras quirúrgicas afiladas/contundentes, un par de tijeras quirúrgicas afiladas/afiladas, y fórceps rectos y curvos.
Desinfectar todos los instrumentos quirúrgicos con 70% de etanol. Coloque un ratón macho adulto eutanizado en su espalda y humedezca las piernas con 70% de etanol. Usando las tijeras quirúrgicas afiladas/contundentes, corta cada pierna entera cortando en la articulación de la cadera.
Coloque las extremidades en un plato de cultivo celular cerrado. Transfiera el plato a una capucha de flujo laminar estéril. Usa tijeras afiladas y fórceps curvos para cortar la piel abierta desde la cadera hasta la punta del dedo del pie.
Usa los fórceps rectos para sostener la almohadilla del dedo del pie o del pie mientras usas los fórceps curvos para pelar la piel desde el dedo del pie hasta la cadera. Para aislar el musculus cuádriceps femoris, cortar el tendón de la rodilla, y cortar el músculo a lo largo del fémur a la cadera. Cortar el tendón de Aquiles para aislar el musculus tríceps surae.
A continuación, corta a lo largo de la tibia a la fosa popliteal y elimina el músculo. Para eliminar los tendones que no se pueden disociar, sostenga los músculos con los fórceps curvos y corte cada tendón apropiado. Agregue 2, 445 microlitros de solución de digestión preparada a un plato de cultivo celular fresco y etiquetado y determine el peso.
Transfiera todas las piezas musculares a este plato. A continuación, determine el peso. La diferencia de ambos valores medidos proporciona el peso seco del tejido muscular que no debe exceder un gramo.
Usando las tijeras afiladas quirúrgicas, corta todo el tejido muscular en trozos pequeños. Incubar la suspensión tisular a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante 1,5 horas, asegurándose de mezclar la suspensión cuidadosamente con una jeringa de insulina de un mililitro cada 20 minutos durante aproximadamente cinco minutos. Después de la incubación, transfiera la suspensión a un colador de nylon de 70 micrómetros colocado en un tubo etiquetado de 50 mililitros y recoja el flujo a través.
Lavar el colador celular con ocho mililitros de DMEM y recoger el flujo a través. Si las piezas están enchufando el colador, resuspender la solución disociada. Deseche el colador celular y centrifugar la suspensión a 300 veces la gravedad y a 20 grados Celsius durante 10 minutos.
Retire cuidadosamente el sobrenadante y resuspendir el gránulo celular en un mililitro de un tampón de alálisis de potasio de cloruro de amonio para la lysis de los glóbulos rojos. Incubar a temperatura ambiente durante 30 segundos. A continuación, agregue nueve mililitros de DMEM que contengan 10%FCS para detener la reacción.
Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros. Luego, utilice una cámara de conteo de células Neubauer para determinar los números de celda. Para comenzar a agotar las células CD45 positivas, centrifugar la suspensión a 300 veces la gravedad y a cuatro grados celsius durante 10 minutos.
Retire el sobrenadante por completo y resuspendir el pellet celular en 90 microlitros de tampón MCS. Añadir 10 microlitros de microperlas CD45 y mezclar la suspensión. Incubar en un refrigerador de cuatro a ocho grados centígrados durante 15 minutos.
Después de esto, agregue un mililitro del buffer MCS. Centrifugar a 300 veces la gravedad y a cuatro grados celsius durante 10 minutos. Retire el sobrenadante completamente y resusppend las células en 500 microlitros del búfer MCS.
Coloque una columna magnética grande en el campo magnético del separador. Enjuague el depósito de la columna con tres mililitros de tampón MCS. A continuación, coloque un tubo cónico de 15 mililitros debajo de la columna para recoger el flujo a través.
Aplique toda la suspensión de celda a la columna y déjela fluir completamente. Lave la columna tres veces añadiendo tres mililitros de tampón MCS en el depósito para cada paso de lavado y esperando hasta que el depósito de la columna esté vacío antes de comenzar el siguiente paso de lavado. Recoja las celdas sin etiquetar que pasan a través de la columna para usarlas en pasos de separación adicionales.
Para comenzar a acumular células CD31 positivas, utilice una cámara de conteo de células Neubauer para determinar los números de celda. Después, centrifugar las células sin etiquetar a 300 veces la gravedad y a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Retire el sobrenadante por completo y resusppend el pellet en 90 microlitros de tampón MCS.
Añadir 10 microlitros de microperlas CD31 y mezclar toda la suspensión. Incubar en un refrigerador de cuatro a ocho grados centígrados durante 15 minutos. Después de esto, agregue un mililitro de tampón MCS y centrífuga a 300 veces la gravedad y a cuatro grados Celsius durante 10 minutos.
Retire el sobrenadante y resusppend las células en 500 microlitros del búfer MCS. Coloque la columna magnética media en el campo magnético del separador. Enjuague la columna con 500 microlitros de tampón MCS.
A continuación, coloque un tubo cónico de 15 mililitros debajo de la columna para recoger el flujo a través. Aplique toda la suspensión de celda en la columna y déjela fluir completamente. Lave la columna tres veces añadiendo 500 microlitros de tampón MCS en el depósito para cada paso de lavado, y espere hasta que el depósito de la columna esté vacío antes de comenzar el siguiente paso de lavado.
Las celdas sin etiquetar que pasan la columna representan la fracción CD45-negativa, CD31-negativa. Guárdelos para más controles de calidad. A continuación, retire la columna del separador y colóquela en un tubo de recogida adecuado.
Pipetear dos mililitros de búfer MCS en la columna. Empuje inmediatamente el émbolo en la columna para vaciar las celdas etiquetadas magnéticamente. Esta fracción CD45-negativa, CD31-positiva representa los CE primarios murinas enriquecidos.
Centrifugar la suspensión celular a 350 veces la gravedad y a 20 grados celsius durante cinco minutos. Retire el sobrenadante por completo y resuspendir las células en un mililitro de medio celular endotelial. Transfiera las células a un solo pozo de una placa de cultivo recubierta de seis pozos que contenga un mililitro de medio celular endotelial.
Para el cultivo, incubar las células a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono en una incubadora estéril, asegurándose de refrescar el medio cada dos o tres días. Cuando las células estén a una confluencia de 80 a 90%, enjuague cada bien con las células dos veces con dos mililitros de PBS en dos pasos de lavado consecutivos. A continuación, agregue 800 microlitros de solución de trippsina EDTA a cada pozo e incubar a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono en una incubadora estéril durante tres a cinco minutos.
Después de esto, agregue 1.200 microlitros de DMEM que contengan al menos 10%FCS para detener la actividad enzimática. Centrifugar a 350 veces la gravedad y a 20 grados celsius durante cinco minutos. Luego, acumule las células CD31 como se describió anteriormente para aumentar la pureza.
Utilice un microscopio de contrato de campo brillante o de fase estándar con un aumento del 20% y una apertura numérica de lente de 0,35 para observar la confluencia celular. En este estudio, se aíslan las células endoteliales microvasculares del músculo esquelético murino primario. Un día después del aislamiento, las MMET murinas primarias y otras células residuales forman conglomerados y se adhieren al fondo de los platos de cultivo.
Desde el séptimo día en adelante, se pueden observar células planas y alargadas, sin embargo, la contaminación de otras células esferoides, en su mayoría sigue siendo visible. Por lo tanto, se requiere otro ciclo de selección CD31-positiva a través de MCS. A partir de ahora, las MMEr murinas primarias proliferan a una densidad de aproximadamente 80 a 90% Tras la confluencia, por lo general forman una monocapa no superpuesta de células alineadas longitudinalmente.
La proliferación se detiene tras la confluencia debido a la inhibición del contacto. El control de calidad a través de la citometría de flujo muestra valores de viabilidad y pureza que oscilan alrededor del 70% cada uno para las células inmediatamente después del aislamiento. Las células cultivadas después de otra selección CD31-positiva a través de MCS muestran valores satisfactorios para la pureza, así como para la viabilidad, que van hasta 95% cada una.
A continuación, se investigan las células obtenidas para la expresión génica de los genes marcadores de células del satélite muscular emparejados con la proteína de caja 7 y la M-cadherina a nivel de ARNm por PCR cuantitativo. Como era de esperar, sólo la fracción CD45 negativa, CD31-negativa, así como las células musculares murinas primarias diferenciadas expresaron proteína de caja 7 y M-cadherina, mientras que CD45 negativo, CD31 positivo y los MMET murinos primarios son negativos para estos marcadores. Después del segundo paso CD31 MCS, qPCR se utiliza para evaluar la expresión de proteínas de unión estrecha en MMEC murinas primarias confluentes.
Se observa que las MMET murinas primarias expresan altos niveles de claudin-5, ocludina y zonula ocludens-1, mientras que pmMC solo muestra una expresión baja de zonula ocludens-1. Esta técnica se puede realizar en cinco a seis horas. Siguiendo este protocolo, se pueden realizar otros métodos como los ensayos de migración o los experimentos de tensión de bajo cizallamiento para responder preguntas adicionales.
Después de ver este video, usted debe ser capaz de aislar las células endoteliales microvasculares primarias de los músculos esqueléticos por disociación mecánica y enzimática y clasificación de células magnéticas.
