Dieses Protokoll beschreibt eine Plattformtechnik, um mikrovaskuläre Endothelzellen von Skelettmuskeln zu isolieren. Diese Zellen können zum Beispiel verwendet werden, um weitere Einblicke in die Funktionen der Blutmuskelbarriere zu gewinnen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden ist, dass es möglich ist, primäre mikrovaskuläre Endothelzellen mit hoher Reinheit zu isolieren.
Diese Technik kann helfen, schlüsselhafte Fragen im Bereich der immunvermittelten Muskelerkrankungen wie die Interaktion zwischen Muskel- und Endothelzellen bei Gesundheit und Krankheit zu beantworten. Bereiten Sie zunächst alle benötigten Lösungen und Sechs-Well-Platten vor, wie im Protokoll beschrieben. Um den praktischen Eingriff zu beginnen, erhalten Sie eine chirurgische scharfe/stumpfe Schere, eine chirurgische scharfe/scharfe Schere und gerade und gekrümmte Zangen.
Desinfizieren Sie alle chirurgischen Instrumente mit 70% Ethanol. Positionieren Sie eine eingeschläferte erwachsene männliche Maus auf dem Rücken und befeuchten Sie die Beine mit 70% Ethanol. Mit der scharfen/stumpfen chirurgischen Schere, schneiden Sie jedes ganze Bein durch Schneiden am Hüftgelenk.
Legen Sie die Extremitäten in eine geschlossene Zelle Kulturgericht. Übertragen Sie die Schale auf eine sterile laminare Fließhaube. Verwenden Sie scharfe Schere und gekrümmte Zangen, um die Haut von der Hüfte bis zur Zehenspitze zu schneiden.
Verwenden Sie die geradezangen Zangen, um die Zeh oder das Fußpolster zu halten, während Sie die gekrümmten Zangen verwenden, um die Haut von der Zeh bis zur Hüfte abzuschälen. Um den Musculus quadriceps femoris zu isolieren, schneiden Sie die Sehne vom Knie und trennen Sie den Muskel entlang des Oberschenkelknochens bis zur Hüfte. Sever die Achillessehne, um den Musculus triceps surae zu isolieren.
Als nächstes entlang der Tibia auf die popliteale Fossa schneiden und den Muskel entfernen. Um Sehnen zu entfernen, die nicht dissoziiert werden können, halten Sie die Muskeln mit den gekrümmten Zangen und schneiden Sie jede geeignete Sehne ab. Fügen Sie 2, 445 Mikroliter vorbereiteter Verdauungslösung zu einer frischen, gekennzeichneten Zellkulturschale hinzu und bestimmen Sie das Gewicht.
Übertragen Sie alle Muskelteile auf dieses Gericht. Bestimmen Sie dann das Gewicht. Die Differenz beider Messwerte ergibt das Trockengewicht des Muskelgewebes, das ein Gramm nicht überschreiten darf.
Mit der chirurgischen scharfen Schere, schneiden Sie das gesamte Muskelgewebe in kleine Stücke. Inkubieren Sie die Gewebesuspension bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für 1,5 Stunden, um sicherzustellen, dass die Suspension sorgfältig mit einer Ein-Milliliter-Insulinspritze alle 20 Minuten für etwa fünf Minuten gemischt wird. Nach der Inkubation die Suspension auf ein 70-Mikrometer Nylonsieb auf einem 50-Milliliter-Beschrifteten Rohr abstellen und den Durchfluss sammeln.
Waschen Sie das Zellsieb mit acht Milliliter DMEM und sammeln Sie den Durchfluss durch. Wenn die Teile das Sieb verstopfen, setzen Sie die dissoziierte Lösung wieder auf. Entsorgen Sie das Zellsieb und zentrieren Sie die Suspension bei 300-facher Schwerkraft und bei 20 Grad Celsius für 10 Minuten.
Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in einem Milliliter eines Ammoniumchlorid-Kaliumlysingpuffers für die Lyse roter Blutkörperchen wieder auf. 30 Sekunden lang bei Raumtemperatur inkubieren. Fügen Sie dann neun Milliliter DMEM mit 10%FCS hinzu, um die Reaktion zu stoppen.
Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Rohr. Verwenden Sie dann eine Neubauer-Zellzählkammer, um die Zellzahlen zu bestimmen. Um mit der Erschöpfung der CD45-positiven Zellen zu beginnen, zentrieren Sie die Suspension bei 300-facher Schwerkraft und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten.
Entfernen Sie den Überstand vollständig und setzen Sie das Zellpellet in 90 Mikroliter MCS-Puffer wieder auf. Fügen Sie 10 Mikroliter CD45 Mikroperlen hinzu und mischen Sie die Suspension. Im Kühlschrank bei vier bis acht Grad Celsius für 15 Minuten brüten.
Fügen Sie danach einen Milliliter MCS-Puffer hinzu. Zentrifuge bei 300-facher Schwerkraft und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Entfernen Sie den Überstand vollständig und setzen Sie die Zellen in 500 Mikroliter MCS-Puffer wieder aus.
Positionieren Sie eine große Magnetsäule im Magnetfeld des Separators. Spülen Sie das Reservoir der Säule mit drei MilliliterN MCS-Puffer. Platzieren Sie dann ein 15-Milliliter-Konusrohr unter der Säule, um den Durchfluss zu sammeln.
Tragen Sie die gesamte Zellsuspension auf die Säule auf und lassen Sie sie vollständig durchfließen. Waschen Sie die Säule dreimal, indem Sie drei Milliliter MCS-Puffer für jeden Waschschritt in das Reservoir einfügen und warten, bis das Reservoir der Säule leer ist, bevor Sie mit dem nächsten Waschschritt beginnen. Sammeln Sie die nicht beschrifteten Zellen, die durch die Spalte gehen, für die Verwendung in weiteren Trennschritten.
Um mit der Anhäufung von CD31-positiven Zellen zu beginnen, verwenden Sie eine Neubauer-Zellzählkammer, um die Zellzahlen zu bestimmen. Anschließend zentrieren Sie die unbeschrifteten Zellen bei 300-facher Schwerkraft und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Entfernen Sie den Überstand vollständig und setzen Sie das Pellet in 90 Mikroliter MCS-Puffer wieder auf.
Fügen Sie 10 Mikroliter CD31 Mikroperlen hinzu und mischen Sie die gesamte Suspension. Im Kühlschrank bei vier bis acht Grad Celsius für 15 Minuten brüten. Danach einen Milliliter MCS-Puffer und Zentrifuge bei 300-facher Schwerkraft und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten hinzufügen.
Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 500 Mikroliter MCS-Puffer wieder aus. Positionieren Sie die mittlere Magnetsäule im Magnetfeld des Separators. Spülen Sie die Säule mit 500 Mikroliter MCS-Puffer.
Als nächstes legen Sie eine 15-Milliliter-Konustube unter der Säule, um den Durchfluss zu sammeln. Tragen Sie die gesamte Zellsuspension auf die Säule auf und lassen Sie sie vollständig durchfließen. Waschen Sie die Säule dreimal, indem Sie 500 Mikroliter MCS-Puffer für jeden Waschschritt in das Reservoir einfügen, und warten Sie, bis das Reservoir der Säule leer ist, bevor Sie mit dem nächsten Waschschritt beginnen.
Nicht beschriftete Zellen, die die Spalte übergeben, stellen den CD45-negativen, CD31-negativen Bruch dar. Bewahren Sie sie für weitere Qualitätskontrollen auf. Entfernen Sie dann die Säule aus dem Trennzeichen und legen Sie sie auf ein geeignetes Sammelrohr.
Pipette zwei Milliliter MCS-Puffer auf die Spalte. Drücken Sie den Kolben sofort in die Säule, um die magnetisch beschrifteten Zellen zu spülen. Diese CD45-negative CD31-positive Fraktion stellt die angereicherten primären murinen ECs dar.
Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 350-facher Schwerkraft und bei 20 Grad Celsius für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand vollständig und setzen Sie die Zellen in einem Milliliter Endothelzellmedium wieder auf. Übertragen Sie die Zellen in einen einzigen Brunnen einer beschichteten Sechs-Brunnen-Kulturplatte, die einen Milliliter Endothelzellmedium enthält.
Für den Anbau, inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid in einem sterilen Inkubator, um sicherzustellen, dass das Medium alle zwei bis drei Tage aufzufrischen. Wenn die Zellen bei 80 bis 90% Konfluss sind, spülen Sie jeden Brunnen, der Zellen enthält, zweimal mit zwei MilliliterPBS in zwei aufeinanderfolgenden Waschschritten aus. Dann fügen Sie 800 Mikroliter Trypsin EDTA-Lösung zu jedem Brunnen und inkubieren bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid in einem sterilen Inkubator für drei bis fünf Minuten.
Fügen Sie danach 1, 200 Mikroliter DMEM hinzu, die mindestens 10% FCS enthalten, um die enzymatische Aktivität zu stoppen. Zentrifuge bei 350-facher Schwerkraft und bei 20 Grad Celsius für fünf Minuten. Sammeln Sie dann die CD31-Zellen, wie zuvor beschrieben, um die Reinheit zu erhöhen.
Verwenden Sie ein helles Feld- oder Standardphasen-Kontraktmikroskop mit 20%vergrößerung und 0,35 Linsen-Numerischer Blende, um den Zellzusammenfluss zu beobachten. In dieser Studie werden primäre murinische Skelettmuskel mikrovaskuläre Endothelzellen isoliert. Einen Tag nach der Isolation bilden primäre murinische MMECs und restliche andere Zellen Konglomerate und haften am Boden von Kulturgerichten.
Ab dem siebten Tag können flache und längliche Zellen beobachtet werden, eine Kontamination anderer, meist sphäroider Zellen ist jedoch noch sichtbar. Daher ist ein weiterer Zyklus der CD31-positiven Auswahl über MCS erforderlich. Danach vermehren sich primäre murinische MMECs bei zusammentreten zu einer Dichte von etwa 80 bis 90%, sie bilden in der Regel eine nicht überlappende Monoschicht längsgebundener Zellen.
Die Proliferation stoppt beim Zusammenfluss aufgrund der Kontakthemmung. Die Qualitätskontrolle über die Durchflusszytometrie zeigt Werte für Lebensfähigkeit und Reinheit, die für Zellen unmittelbar nach der Isolierung jeweils etwa 70 % betragen. Zellen, die nach einer anderen CD31-positiven Selektion über MCS kultiviert werden, zeigen befriedigende Werte für Reinheit und Lebensfähigkeit, die jeweils bis zu 95% betragen.
Die erhaltenen Zellen werden dann auf die Genexpression der Muskelsatellitenzell-Markergene gepaartes Box-Protein 7 und M-Cadherin auf mRNA-Ebene mittels quantitativer PCR untersucht. Wie erwartet exprimierten nur die CD45-negative, CD31-negative Fraktion sowie die differenzierten primären murinen Muskelzellen das Boxprotein 7 und M-Cadherin, während CD45-negativ, CD31-positiv und die primären murinen MMECs für diese Marker negativ sind. Nach dem zweiten CD31 MCS-Schritt wird qPCR verwendet, um die Expression von engen Knotenproteinen in konfluenten primären murinen MMECs zu bewerten.
Primäre murinische MMECs exprimieren hohe Konzentrationen von Claudin-5, Occkluin und Zonula occludens-1, während pmMC nur einen niedrigen Ausdruck von Zonula-Okkludens-1 zeigt. Diese Technik kann in fünf bis sechs Stunden durchgeführt werden. Im Anschluss an dieses Protokoll können andere Methoden wie Migrationstests oder Low-Shear-Stressexperimente durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten.
Nach dem Betrachten dieses Videos sollten Sie in der Lage sein, primäre mikrovaskuläre Endothelzellen durch mechanische und enzymatische Dissoziation und magnetische Zellsortierung von Skelettmuskeln zu isolieren.
