この作品は（PALとK99HL116769 AJTにするR01HL056046）国立衛生研究所によってサポートされ、全国小児病院で研究所（PALとAJTへ）しました。

倫理に関する声明：この研究は健康ガイドラインの国立研究所に従って実施したところ、全国の小児病院での法人動物実験委員会によって承認されました。 1.準備/設定します注：この分離技術は、リングスタンド上に並べて配置された2つのランゲンドルフ加熱コイルを必要とし、循環水浴に並列に接続されています。 <ol><li>水浴を循環をオンにして、ランゲンドルフカニューレの先端に33-34℃の最終温度を達成するために温度を調整します（この中で使用される水浴が原因で6-7°Cの損失を40℃に設定されている設定しましたチューブの両端の温度で）。灌流ポンプの電源をオンにし、0.5ml /分に灌流速度を設定します。 <ol><li>オートクレーブ滅菌超純水100ミリリットルに続いて、70％のエタノール50mlでそれぞれをフラッシュすることにより、水ジャケット加熱コイル、添付のチューブと25ゲージのカニューレの両方をきれいにしてください。 </li><li>加熱コイルをクリアシリンジで空気を押して、フェノールレッドを含まないハンクス平衡塩溶液（HBSS）10mlで洗浄します。加熱コイルとチューブにHBSSを残します。 </li><li>チューブへのフェノールレッドを含まない室温HBSSで満たした滅菌10ミリリットルルアーロックシリンジを取り付けます。これは負のVSMCの分離に影響を与えると消化中に空気塞栓を引き起こす可能性としてHBSS充填された注射器を取り付けるときに気泡がチューブと加熱コイルの中に閉じ込められていないことを確認します。 </li></ol></li><li>フェノールレッドなしの氷冷HBSSで満たされた別の滅菌10ミリリットル注射器の加熱コイルと場所から25ゲージのカニューレを外します。使用する準備ができるまで氷上にこれを保管してください。他のカニューレのために繰り返します。 </li><li>酵素消化ソリューションを準備します。 <ol><li>消化溶液75mlを300単位/ mlの最終濃度を達成するための特定のロット番号に応じてコラゲナーゼタイプ2を量ります。 </li><li>フェノールレッドとHBSSの75ミリリットルにコラゲナーゼを溶解させます。次に、0の1.5ミリリットルを追加します。0.1 mg / mlで大豆トリプシン阻害剤との混合物に1 MのCaCl 275μlの。 </li></ol></li><li>すぐに消化溶液を使用する場合、37゜Cに温め。ない場合は、最大6時間、4℃でそれを置きます。このソリューションは、毎日新鮮な作られなければなりません。 </li><li>停止液/メッキメディアを準備します。 <ol><li>高グルコース500mlの100 mlの熱不活性化FBS、L-グルタミン5mlの非必須アミノ酸を5ml、HEPES 5mlの、及びprimocin 1 mlを加え（4.5グラム/ L）DMEM。フィルター滅菌は推奨されます。 </li><li> 4℃で12 15ミリリットルの各円錐管、番号のA1-A6とB1〜B6、および所定の位置に停止溶液のアリコート6ミリリットル。アリコートを37℃のインキュベーター中で、50mLの円錐形と所定の位置に停止溶液50ml。 注：必要な場合は、このステップはまた、単離の前に一日に調製することができます。この停止液は、細胞単離後めっき媒体として使用されます。 </li></ol></li><li> 30 G針を装備した2 1ミリリットル注射器を準備しますヘパリン100μlのと（千単位/ ml）。 </li><li> 5-0手術用絹の5cmの部分をカットします。他のように2倍の長一端との外科シルクに緩いオーバーハンド結び目を作ります。 25ゲージのカニューレ上に置きますが、締めないでください。他の25のGカニューレに対して繰り返します。 </li><li>フェノールレッドを含まない滅菌、氷冷の2ミリリットル、HBSSで4 35ミリメートル滅菌ペトリ皿（＃1-4）を入力します。氷の上に保管してください。 </li></ol> 2.安楽死、心臓の単離およびカニューレ挿入<ol><li>心分離する前に、消化液と停止液の50ミリリットルの円錐形が暖かいであることを確認してください。リングスタンドにビュレットクランプ（またはリングスタンドクランプ）で氷と場所から添付さ25 GカニューレでHBSSフィルドシリンジを取り外します。 </li><li> 3％のイソフルランを用いてマウスを麻酔。マウスは、各後肢につま先タッチで麻酔をかけていることを確認します。足のけいれん場合は、マウスはまだそれほど1分待ってからつま先タッチを繰り返して麻酔されていません。 </li><li>毛皮aを除去することにより、頸静脈を公開はさみで首の前方の皮膚をND。次に、慎重に頸静脈の周囲の任意の脂肪を除去するために鉗子を使用しています。脂肪を除去した後、ゆっくりとヘパリン100μlの（千単位/ ml）を注入します。過度の出血を避けるために、静脈の上に手術用ス​​ポンジを置きます。 </li><li> 1分後、開胸は、最初の腕頭枝を介してそのまま上行大動脈を維持することを確認すること、曲がったピンセットで心臓、リフト心臓を露出し、はさみを使用して、それを切除します。すぐにフェノールレッドを含まない氷冷HBSSで35mmディッシュ（＃1）に心を置き、すすぎます。 注：解剖スコープを使用して、次の4つのステップを実行します。 </li><li>先端がちょうど皿＃2の氷冷HBSSの表面の下に位置し、解剖顕微鏡を通してはっきりと見えるされるように位置リングに搭載されている25 Gカニューレは、45°の角度で立ちます。皿＃2に心を転送します。 </li><li>デュモン鉗子を使用して、そっとpまでの鈍的切開を介して、余分な脂肪を除去することによって大動脈を露出させます大動脈のrevent穿刺または引き裂きます。次に、25 Gカニューレを介して大動脈をスライドする鉗子を使用しています。 </li><li>ではなく、弁の完全性、したがって、逆行性灌流を危うくします大動脈弁、を越えて、に近い、大動脈を通って下方カニューレを導きます。カニューレが適所に配置されると、大動脈上に予め結んだシルクをスライドさせて、締めます。心を確保するために、大動脈の周りの正方形の結び目を形成するために、第2の結び目を作ります。 </li><li>大動脈が確実に接続されていたら、静かに25 Gカニューレに取り付けたシリンジ内の氷冷HBSSと冠循環から残りの血液を洗い流します。過度の冠状動脈の圧力を避けるために、あまりプッシュしないように注意してください。唯一の非常に遅く、穏やかなフラッシュは、フラッシュを完了するために必要とされます。漏れのない大動脈カニューレ挿入は、この穏やかなフラッシュ中に観察することができます。 </li><li> HBSSの流れを開始するために灌流ポンプをオンにします。に注意しながら、HBSS充填されたシリンジから（添付心で）25 Gカニューレを削除しますHBSSで満たされたカニューレハブを保ち、暖かいHBSSで満たされた加熱コイルに接続します。 8分間0.5ミリリットル/分の速度で灌流ポンプと心臓の灌流を開始します。 </li><li>最初の心臓がカニューレを挿入され、システム上で灌流された後、繰り返しは第二の心臓のために2.1から2.8を繰り返します。これらのアイソレーションは、慎重な計画とタイミングが要求され、したがって各心臓のために互い違いに配置されます。 </li></ol> 3.消化<ol><li> HBSSで洗浄した後、予め温め消化溶液10mlを充填した1に、現在のポンプに10ミリリットルのHBSSシリンジを変更します。 /分0.5ミリリットルの流量で12分間消化液で各心臓を灌流。これは、任意の残留血液および内皮細胞が含まれていますように、この最初の消化に由来する画分を収集することはありません。 </li><li> 12分後、0.4 ml /分の灌流速度を変更し、冷停止solutを充填した（各消化に第一または第二の心臓に対応するチューブA1またはB1）15mLの円錐を配置VSMCに富む灌流液の収集を開始するために、心臓の下に氷のバケツへのイオン。 </li><li> 15分後、すぐに両方の画分を集めた後、10分間、89×gでチューブA2またはB2とスピン円錐管A1とB1に収集円錐形を変えます。ポンプの消化液が充填された注射器は、溶液の1ml未満である場合には、消化液の新たに充填された10mlのシリンジで置き換えます。 </li><li>遠心分離後、各コレクションチューブから吸引上清は、0.5程度ミリリットル残します。温かい停止液（またはメッキメディア）の2mlでA1からペレットを再懸濁し。緩いキャップで37℃のインキュベーターでA1管からB1チューブと場所チューブに再懸濁を追加します。 </li><li>すべてのチューブ（A6とB6を介して）は90分の合計収集時間のために使用されるまで繰り返し、3.3と3.4を繰り返します。消化の80分で、respe、心室の中に閉じ込められてもよい任意の細胞を洗い流し、管A6とB6でこれらの細胞を収集するために、心尖部を切断してオープンctively。 注意：時々の心は90分の時点より前にカニューレをオフに分類されます。この問題が発生した場合、心臓を取り出し、消化溶液の2ミリリットルを充填した滅菌35ミリメートルのペトリ皿に置きます。心尖​​をカットし、静かに消化液で心臓をすすぎます。次に、50ミリリットルの円錐形に滅菌100μmのセルストレーナーを介して消化溶液の2ミリリットルをフィルタリングし、チューブA6やB6に追加します。 </li><li>その後のチューブ（A2とB2）の各スピンした後、以前のコレクションチューブ（組み合わせA1とB1）に再懸濁させたVSMCを追加します。また、ポンプ内の消化液が出て実行し、消化を通して、必要に応じて10ミリリットル注射器を切り替えることができないように注意してください。 </li><li>すべてのチューブを組み合わせた後、10分間89×gでVSMC富む懸濁液を遠心分離します。 </li><li>できるだけ回収チューブから吸引除去などの多くの上清。 1 35mm培養皿上のメディアとプレートメッキの2ミリリットルの残りのペレットを再懸濁。場所培養皿の私24時間37℃のインキュベーターのn。 </li></ol> 4.細胞培養注：バイオセーフティキャビネット内の残りの手順を完了します。 <ol><li> 24時間後、静かにメッキメディアを吸引除去します。文化は、通常の破片が大量にあります。細胞を洗浄するために、暖かい、滅菌PBSの2ミリリットルを追加し、時計回りの動きで回転させながら穏やかに2本の指に対して皿をタップします。 </li><li> 360度回転した後、PBSを吸引し、二回目を繰り返します。 PBSを吸引し、滅菌、温かいPBSの別の2ミリリットルを追加します。プレート上の無破片のほとんどがあることを確認する顕微鏡下で培養皿を確認してください。細胞合流には、この時点で決定することができます。 </li><li>デブリが培養皿に残っている場合は、ステップ4.2を繰り返します。培養皿は、破片のクリアされている場合、PBSを吸引し、暖かいメッキメディアの2ミリリットルを追加します。 </li><li> 24時間後、培養物から任意の最終的な破片や死んだ細胞を除去するために暖かい、滅菌PBSで再び細胞を洗浄します。 PBSおよびpを吸引細胞上に暖かいメッキメディアの別の2ミリリットルをひもで締めます。 </li><li>毎日細胞にチェックして、新鮮な温めメッキのメディアで48時間ごとを養います。この時点で、細胞は、標準的な細胞培養アッセイのために使用することができます。 VSMCを、プロシージャが完成するまで7日程度かかるかもしれないが、メッキ後、約80％コンフルエント4-5日でなければなりません。 4 35ミリメートル皿（または培養皿の同等の面積に）：その後の継代に分割した場合、1の最大値を使用します。 </li></ol>

<ol>
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著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

この研究の目的は、マウスの心臓からの滑らかな冠血管の収量を増加させるために、既存の細胞単離プロトコールを適合させることでした。血管平滑筋の生物学における先駆的な仕事の大部分は培養ラット大動脈平滑筋細胞を用いて行きました。これらの研究は、VSMC増殖、移動および肥大7を制御する分子機構の基本的な知識を提供しました。フィールドが進むにつれてしかし、それ...

この方法の目的は、細胞培養と、標準的な細胞培養アッセイで使用するために、マウス冠循環の血管平滑筋細胞（VSMC）を単離することです。我々は、糖尿病における血管リモデリングの分子機構を評価するためにこの技術を開発しました。我々は以前、糖尿病1のdb / dbマウスモデルにおける中隔の冠状動脈に肥大改造内側に報告しています。マウス中隔冠状動脈に見られる組織の限られた量を、デシベル/ dbのマウスおよび対照マウスにおけるタンパク質の変化（ 例えばウェスタンブロット）を調査し、標準的な実験技術は、最高の状態では困難です。加えて、我々は以前に、アンジオテンシン受容体遮断薬は、（ARB）が、ロサルタンでのdb / dbマウス2で観察されたリモデリングを減少することが示されています。したがって、冠循環からの一次VSMCをの単離は、私たちがさらにcontribuかもしれ糖尿病マウスにおけるVSMC表現型または活性化のシグナル伝達経路の変化を調査することができます有害冠状動脈リモデリングにティン。 多くの研究はむしろ、各特定の血管床に比べ、齧歯類大動脈から単離したVSMCを使用して、標準的なシグナル伝達経路を解明しました。しかし、私たちは、それぞれの血管床でのVSMCは異なる可能性があり示唆し、血管床冠動脈、大動脈内の特定のリモデリング、およびデシベル/ dbマウス1の腸間膜循環を実証しました。したがって、より良いたVSMCの各セットに生じる病理学的変化を理解するために、各血管床からのVSMCを単離することが必要です。大動脈のVSMCを単離し、培養するための異なる方法の茄多があります。しかし、現在、マウス冠循環3からのVSMCを単離する上で公開されている唯一の研究があります。テンら 。マウス冠循環からのVSMCを単離するための方法を報告した最初の。しかし、我々は、彼らはまた、単離された内皮セル画のように大幅にプロトコルを修正していますlsの。他のラボはまた、テンらからプロトコルを使用している。冠状動脈筋細胞及び気道平滑筋細胞4,5を分離します。私たちが組み込まれているの変化は非常に冠循環からのVSMCのために濃縮された細胞の集団が得られます。 単離された哺乳動物の心臓、またはランゲンドルフ技術の逆行性灌流は、オスカーランゲンドルフによって1897年6に設立され、現在でも広く心血管細胞の単離のために今日使用されています。現代のマウス遺伝子改変の進歩と相まってここで紹介する技術は、冠循環からのVSMCの分子挙動の近い調査のための貴重なツールを提供します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="758">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">16140-071</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">HEPES 1M solution</td>
			<td style="width:143px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">MT-25-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primocin - 20mL</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM (High Glucose, Sodium Pyruvate, L-Glutamine)&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM NEAA 10 mM 100X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glut 200 mM - Gibco</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile Cell Strainer 100um nylon mesh</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunclon Polystrene dish with lid, sterile, 35 mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-565-91</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Harvard Apparatus black silk suture 5-0</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-516-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase Type-2&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soybean Trypsin Inhibitor 25mg</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (clear)</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td>14175-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (phenol red)</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td>14170-161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5.0 ml heating coil with degassing bubble trap</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>158830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">11 plus pump</td>
			<td style="width:143px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:119px;">70-2208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Circulating heated water pump</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any brand will work</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of murine coronary vascular smooth muscle cells

大血管からの血管平滑筋細胞（VSMC）の単離および培養物が十分に確立されているが、我々は、冠循環からのVSMCを単離し、培養しようとしました。無傷の大動脈弓と心臓をコラゲナーゼタイプIIの300単位/ ml、0.1mg / mlの大豆トリプシン阻害剤および1MのCaCl 2を含有する消化溶液で逆行ランゲンドルフによって除去し、潅流しました。灌流液は、90分間、15分間隔で採取し、遠心分離によってペレット化し、培地をめっき中に再懸濁し、そして組織培養皿上にプレーティングしました。 VSMCをはSM22α、α-SMA、およびビメンチンの存在によって特徴付けられました。この技術を使用することの主な利点の一つは、マウスの冠循環からのVSMCを隔離する能力です。得られた細胞の数が少ないセルを利用することができるため、アプリケーションの一部を制限することができるが、単離された冠状動脈のVSMCは、十分に確立された細胞培養技術とASSA種々のに使用することができますYS。遺伝的に改変されたマウスからのVSMCを調査研究は、構造機能および血管の病理に関連したシグナル伝達過程に関するさらなる情報を提供することができます。

我々の冠状VSMC分離技術の新規な態様に、我々は、細胞単離の純度を決定しようとしました。マウス冠状動脈のVSMCは、第一洗浄後の培養中の細胞の形態に基づいて通路2にその形態および免疫蛍光染色アップに基づいて同定された、単離手順は、効果的に心筋細胞および内皮細胞を除去します。 VSMCは、通路2（ 図1）までその形態を保持しています。しかし...

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Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

このプロトコルの目的は、冠循環からマウスの一次血管平滑筋細胞（VSMC）の単離および培養技術を実証することです。たVSMCが単離されたら、それらは、多くの標準的な培養技術のために使用することができます。

マウス冠動脈血管平滑筋細胞の単離

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

isolation-of-murine-coronary-vascular-smooth-muscle-cells

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K ビュー.  The Ohio State University College of Medicine. このプロトコルの目的は、冠循環からマウスの一次血管平滑筋細胞（VSMC）の単離および培養技術を実証することです。たVSMCが単離されたら、それらは、多くの標準的な培養技術のために使用することができます。 

ビデオ: Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ from internal stores, and allows multiple cells to be monitored simultaneously to assess, for example, coupling in syncytial tissue. Subcellular Ca2+ transients are common in smooth muscle, yet are difficult to measure accurately because of the problems caused by their stochastic occurrence, over an often wide field of view, in an organ that it prone to contract. To overcome this problem, we've developed a series of imaging protocols and analysis routines to acquire and then analyse, in an automated fashion, the frequency, location and amplitude of such events. While this approach may be applied in other contexts, our own work involves the detection of local purinergic Ca2+ transients for locating transmitter release with submicron resolution. 
ATP is released as a cotransmitter from autonomic nerves, where it binds to P2X1 receptors on the smooth muscle of the detrusor and vas deferens. Ca2+ enters the smooth muscle, resulting in purinergic neuroeffector Ca2+ transients (NCTs). The focal Ca2+ transients allow the optical monitoring of neurotransmitter release in a manner that has many advantages over electrophysiology. Apart from the greatly improved spatial resolution, optical recording has the additional advantage of allowing the recording of transmitter release from many distinguishable sites simultaneously. Furthermore, the optical plane of focus is easier to maintain or correct during long recording series than is the repositioning of an intracellular sharp microelectrode. 
In summary, a method for imaging of Ca2+ fluorescence is outlined which details the preparation of tissue, and the acquisition and analysis of data. We outline the use of several scripts for the analysis of such Ca2+ transients.

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Details methods for high-resolution Ca2+ imaging of smooth muscle within isolated organs, including: preparation of the tissue, image acquisition and data analysis.

焦点のCa 2 +</sup平滑筋の>過渡検出

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

生物学

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded and their collection does not imply any added risk to the newborn or mother s health. Moreover no ethical concerns are raised. The UC is composed by one vein and two arteries from which both endothelial cells (ECs) 1 and smooth muscle cells (SMCs) 2, two of the main cellular components of blood vessels, can be isolated. In this project the SMCs were obtained after enzymatic treatment of the UC arteries accordingly the experimental procedure previously described by Jaffe et al 3. After cell isolation they were kept in t-flash with DMEM-F12 supplemented with 5% of fetal bovine serum and were cultured for several passages. Cells maintained their morphological and other phenotypic characteristics in the different generations. The aim of this study was to isolate smooth muscle cells in order to use them as models for future assays with constrictor drugs, isolate and structurally characterize L-type calcium channels, to study cellular and molecular aspects of the vascular function 4 and to use them in tissue engineering.

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

The umbilical cords are used to isolate smooth muscle cells by different ways. In this work we used the enzymatic treatment to isolated smooth muscle cells.

ヒト臍帯動脈平滑筋細胞の単離（HUASMC）

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

大人と胚骨格筋のMicroexplantの文化と骨格筋幹細胞の単離

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

Brown adipocytes have the ability to uncouple the respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat. Development of UCP1-positive brown adipocytes in white adipose tissues (so called beige or brite cells) is highly induced by a variety of environmental cues such as chronic cold exposure or by PPAR&gamma; agonists, therefore, this cell type has potential as a therapeutic target for obesity treatment. Although most immortalized adipocyte lines cannot recapitulate the process of "browning" of white fat in culture, primary adipocytes isolated from stromal vascular fraction in subcutaneous white adipose tissue (WAT) provide a reliable cellular system to study the molecular control of beige/brite cell development. Here we describe a protocol for effective isolation of primary preadipocytes and for inducing differentiation to beige/brite cells in culture. The browning effect can be assessed by the expression of brown fat-selective markers such as UCP1.

Primary white preadipocytes isolated from white adipose tissues in mice can be differentiated into beige/brite cells. Presented here is a reliable cellular model system to study the molecular regulation of "browning" of white fat.

ベージュ/ブライト細胞間質血管細胞の単離と分化

Brown adipocytes have the ability to uncouple the  respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat.  Development of UCP1-positive ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

筋衛星細胞の単離、培養、および移植

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling pathways involved in vascular smooth muscle contraction in PASMC from fetal sheep. While sheep make an excellent model of term pulmonary hypertension, they are very expensive and lack the advantage of genetic manipulation found in mice. Conversely, the inability to isolate PASMC from mice was a significant limitation of that system. Here we described the isolation of primary cultures of mouse PASMC from P7, P14, and P21 mice using a variation of the previously described technique of Marshall et al.26 that was previously used to isolate rat PASMC. These murine PASMC represent a novel tool for the study of signaling pathways in the neonatal period. Briefly, a slurry of 0.5% (w/v) agarose + 0.5% iron particles in M199 media is infused into the pulmonary vascular bed via the right ventricle (RV). The iron particles are 0.2 &#956;M in diameter and cannot pass through the pulmonary capillary bed. Thus, the iron lodges in the small pulmonary arteries (PA). The lungs are inflated with agarose, removed and dissociated. The iron-containing vessels are pulled down with a magnet. After collagenase (80 U/ml) treatment and further dissociation, the vessels are put into a tissue culture dish in M199 media containing 20% fetal bovine serum (FBS), and antibiotics (M199 complete media) to allow cell migration onto the culture dish. This initial plate of cells is a 50-50 mixture of fibroblasts and PASMC. Thus, the pull down procedure is repeated multiple times to achieve a more pure PASMC population and remove any residual iron. Smooth muscle cell identity is confirmed by immunostaining for smooth muscle myosin and desmin.

We have developed a novel and reproducible technique to isolate primary cultures of pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC) from mice as young as P7, thereby allowing better study of the signaling pathways involved in neonatal smooth muscle cell contraction and relaxation.

新生児マウスから肺動脈平滑筋細胞の単離

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

ネズミ弁内皮細胞の単離

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

マウス大動脈内皮細胞の単離および初代培養

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new vascular formation. Endothelial cell dysfunction is implicated in the development and progression of many cardiovascular diseases including ischemic heart disease. To examine the function and characterization of coronary endothelial cells, cell isolation is the first step and it requires high purity and quantity to conduct subsequent experiments. This protocol describes an efficient method to isolate adult mouse coronary endothelial cells. The mouse heart is dissected and minced into small pieces. After the digestion of the heart using dispase and collagenase II, cells are washed&#160;and incubated with magnetic beads which are conjugated with anti-CD31 antibody. The beads with endothelial cells are washed several times and are ready to use in various applications, including imaging and molecular biological experiments. Efficient isolation yields approximately 104 cells per one heart with over 90% purity.

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

マウスの冠動脈内皮細胞の単離

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation. Common murine models study small vessels such as the carotid and femoral arteries. Herein we describe an in vivo system in which both VSMC proliferation and endothelial barrier function can be simultaneously assessed in a large vessel. We studied the infrarenal aortic response to injury in C57BL/6 mice. The aorta was injured from the left renal vein to the aortic bifurcation by 30 transmural crushes of 5-seconds duration with a cotton-tipped applicator. Morphological changes were assessed with conventional histology. Aorta wall thickness was measured from the luminal surface to the adventitia. EdU integration and counter staining with DAPI and alpha-actin was used to demonstrate VSMC proliferation. Activation of ERK1/2, a known moderator of intimal hyperplasia formation, was determined by Western Blot analysis. The effect of inflammation was determined by immunohistochemistry for B-cells, T-cells, and macrophages. En face sections of endothelium were visualized with scanning electron microscopy (SEM). Endothelial barrier function was determined with Evans Blue staining. Transmural injury resulted in aortic wall thickening. This injury induced VSMC proliferation, most prominently at 3 days after injury, and early activation of ERK1/2 and decreased p27kip1 expression. Injury did not result in increased B-cells, T-cells, or macrophages infiltration in the vessel wall. Injury caused partial endothelial cell denudation and loss of cell-cell contact. Injury resulted in a significant loss of endothelial barrier function, which returned to baseline after seven days. The murine transmural blunt aortic injury model provides an efficient system to simultaneously study both VSMC proliferation and endothelial barrier function in a large vessel.

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Restenosis following cardiovascular procedures (bypass surgery, angioplasty, or stenting) is a significant problem reducing the durability of these procedures. An ideal therapy would inhibit smooth muscle cell (VSMC) proliferation while promoting regeneration of the endothelium. We describe a model for simultaneous assessment of VSMC proliferation and endothelial function in vivo.

ネズミ大動脈挫傷：効率的<em&gt;インビボ</em&gt;平滑筋細胞の増殖と内皮機​​能のモデル

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell ...