私たちのプロトコルは、全身感染モデルから自然な経口経路を介した細菌投与を可能にするモデルにG.mellllellaの使用を拡大します。G.mellonellaは、幼虫がヒト病原性細菌に使用できるため、先天的なマイクロポスト相互作用の異なる特徴を分析するげっ歯類に適した代替モデルです。大人の蛾によって産まれた卵を、暗闇の中で30°Cのワックスガ基板を含む2リットルの箱に移すことから始めます。
1~2週間後、小さくて小さな幼虫が見えるようになると、基板を含む25グラムの幼虫を新鮮な基材に移します。幼虫をその大きさに応じて2週間後に、ワックスガ基板上の新しい2リットル容器の中の30〜40匹の幼虫のグループに同期させます。2週間後、実験用の幼虫を体重で選択します。
180〜200ミリグラムの質量を持つ淡い、速く動く幼虫のみを使用しています。幼虫に強制的に餌を与えるために、経口塗布のために鈍い針でインスリン注射器をロードし、幼虫1回当たりDPBSの10マイクロリットル当たり10〜7番目の細菌を1回ずつ服用する。注射器をマイクロシリンジポンプに積み込みます。
幼虫が口の部分を開くのを待ってから、下顎の間に注射器を慎重に挿入し、細菌を送達します。幼虫のすべてが供給されたら、1〜24時間の間に摂氏37度で暗闇の中で動物をインキュベートします。幼虫加工の場合は、RNase汚染を防止するためのエタノールとスプレー試薬で安全フードを洗浄してください。
スナップは、液体窒素中の生きている幼虫を凍結します。乳鉢と害虫と少量の液体窒素を使用して、個々の凍結幼虫を均質化します。粉末ホモゲン酸が製造されたら、ホモゲン酸を使い捨て待ちボートに移し、液体窒素が蒸発するのを待ちます。
幼虫のすべてが均質化されたら、粉末ホモジナイートを2ミリリットルチューブに1ミリリットルのTRIzolと混合します。混合物を室温で1時間インキュベートする。インキュベーションの終わりに、遠心分離によってホモゲネートをペレットする。
上清を新しいチューブに移します。上清を1-ブロモ-3クロロプロパン(BCP)の200マイクロリットルと混ぜます。渦を起分し、室温で5分間インキュベートし、続いて氷の上に10分間インキュベーションを行います。
第2インキュベーションの終わりに、BCPを加えた反応を遠心分離し、上部透明層を新しい2つのミリリットルチューブに移す。5分間チューブを混合および反転させることにより、移管した上層のRNAを500マイクロリットルのイソプロパノールで沈殿させます。次いで遠心分離により沈殿したRNAを回収する。
沈殿したRNAペレットを75%エタノールの500マイクロリットルで洗浄し、室温で5~10分間RNAを乾燥させます。エタノールが蒸発したら、リボヌクレアーゼ阻害剤を100マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水に加えて乾燥したRNAペレットに加え、ペレットが完全に溶解するまでチューブを慎重に渦液化する。標準プロトコルでRNAの品質と量を測定し、260~280の比が約2、260~230の比が2~2.2の範囲であることを確認します。
次に、DNaseの消化および遺伝子発現解析のために、標準的なプロトコルに従って、単離されたRNAの5マイクログラムを使用します。G.mellonellaは、細菌が検出されるまで、細菌の負荷を与えられた初期力をクリアすることができます。16s遺伝子コピー数はB.vulgatusと大腸菌の両方で24時間以内に大幅に減少した。
コメンサル投与されたG.mellonella幼虫は、様々な自然免疫マーカー遺伝子のRNA遺伝子発現を誘導する。例えば、LPS認識分子、アポリポホリンおよびヘモリンは、一般に、幼虫を投与したB.vulgatusと比較して大腸菌投与幼虫においてより高く発現される。また、B.vulgatusに比べ、大腸菌の摂食時に活性酸素や窒素の生成が強くアップレギュレートされ、抗酸化GST遺伝子発現も強く行われています。
また、B.vulgatus力の摂食に応答するよりも、大腸菌投与後のペプチド発現の差動が強く誘導される。健康で白く、速く動く幼虫のみを使用し、幼虫にストレスを与えないように力を与える間に忍耐を使用し、必要なすべてのコントロールを含めることを忘れないでください。G.mellonella免疫マーカーの活性化は、RUSまたはGST活性アッセイによって直接決定することができ、ANPの存在量は細菌増殖阻害アッセイによって決定することができる。
この技術は、多くの脊椎動物を犠牲にすることなく、腸の共生生物および病理生物を探索するための、コメンサルおよび病原性細菌のスクリーニングツールとして使用することができる。液体窒素、BCP、またはTRIzol物質を扱う場合は、常に適切な個人用保護具を使用してください。
