このプロトコルは、ミクログリアを染色し、定量密度と形態解析を行うだけでなく、脳へのマクロファージ浸潤を定量化する方法を示します。この技術により、研究者はミクログリア分布と形態の変化を定量的に測定し、ミクログリアをマクロファージの浸潤から区別することができます この分析プロトコルは、他の動物モデルに簡単に適用して、抗IBA1および抗TMEM119抗体が利用可能な微小グリア分布および形態の変化を測定することができます。実験条件に対して失明した細胞数と痕跡を行い、この手順の実行方法に一貫性を持たせたい。
この手順を開始するには、最寄りの近傍距離プラグインがインストールされているフィジーまたは ImageJ などの画像処理プログラムを開きます。スケールがファイルのメタデータに含まれ、メタデータから自動的に設定されていない場合は、20X イメージを開きます。メニューバーで[分析]、[尺度の設定]の順に選択し、正しい情報を入力します。
イメージに刻印された縮尺に基づいて手動で尺度を設定するには、[直線] ツールを選択します。スケールの端にカーソルを置き、Shift キーを押しながら、イメージ上のスケールにできるだけ近い線を描画します。[分析]、[尺度の設定] の順に選択します。
ウィンドウがポップアップし、ピクセルの長さ単位あたりの距離を決定するために、正しい既知の距離と長さの単位を配置し、[OK]をクリックします。次に、[イメージ]、[色]、[合成を作成] を選択して、すべてのチャネルの合成イメージを作成します。メニュー バーで、[分析]、[測定の設定] の順に選択します。領域、中心心、周囲を確認します。
[リダイレクト先] ドロップダウン メニューで、[ファイルを開く] を選択して [OK] をクリックします。[画像]、[色]、[チャンネル ツール] に移動してチャネル ツールを開きます。フリーハンド選択ツールを使用して、対象領域の周囲に大まかな周囲を描画します。ツール バーの [楕円] ツールをダブルクリックして、選択ブラシ ツールを有効にします。
[選択ブラシを有効にする]ボックスがオンになっていることを確認し、[OK]をクリックします。選択ブラシを使用して、対象領域に最適に合うように周長を調整し、この領域全体のキーボードの T キーを押して Y マネージャを矢印します。[分析]、[測定]または[M キーを押す]を選択すると、[結果]ウィンドウがポップアップ表示されます。結果をコピーしてデータシートに貼り付け、その領域に関する情報を保存します。
対象領域の領域をコピーした後、その情報をクリックして Backspace キーを押すと、[結果] ウィンドウの情報が基になります。ROI マネージャ ウィンドウを選択し、ROI トレースを選択し、[名前の変更] をクリックしてイメージの名前に一致するように名前を変更します。[OK]をクリックし、ROI トレースの新しい名前を右クリックして保存します。
ツールバーのブラシツールをダブルクリックします。黒色とブラシサイズを10個選択します。[オーバーレイにペイント]オプションがオフになっていることを確認します。
TMEM119チャンネルでは、TMEM119陽性ミクログリアごとに、ソーマの中心に黒い点を慎重に配置します。TMEM119 の場合は、正のセルの中央に白い点を配置します。対象領域に含まれるすべてのセルに対して同じ手順を繰り返します。
次に、各チャンネルのウィンドウが表示されます。.ドット注釈を持つチャネルを識別し、他の 2 つのウィンドウを閉じます。新しいスプリットチャンネルイメージをリダイレクトするには、分析、測定の設定に進みます。
[リダイレクト先] ドロップダウン メニューで、[チャンネル イメージの分割] を選択し、[OK] をクリックします。次に、[イメージ]、[タイプ]、[8 ビット] の順に選択します。[画像調整] に移動し、[しきい値] を選択します。両バーの左端までスライダーを調整します。
これで、白く表示される黒い点のみが残ります。[ROI マネージャ]ウィンドウで、対象地域を選択します。メニューバーで、分析、パーティクルの解析を選択します。
[サイズ] のテキスト ボックスに 1 ~ 20 を入力します。ピクセル単位のボックスはオフの状態に保たれますが、[結果の表示]、[集計]、[マネージャーに追加] のチェックボックスをオンにする必要があります。[OK]をクリックすると、ポイント数を示す[概要]ウィンドウが表示されます。
この情報をコピーしてデータシートに貼り付けます。次に、プラグイン NND を選択して、NND ウィンドウを表示します。各数値は、各ミクログリアが最も近い微小グリアまでの距離を表します。
この情報をすべてコピーして、データシートに貼り付けます。[しきい値] ウィンドウに戻り、上部のスライダーを右に調整すると、すべての白い点が表示され、白く表示されます。[解析]、[パーティクルの解析]を選択して、[パーティクルを解析]ポップアップ ウィンドウを表示します。
[OK] をクリックして、ポイント数を示す [概要] ウィンドウを表示します。この情報をコピーしてデータシートに貼り付けます。ROI マネージャに移動し、すべてのポイントを選択します。
次に、右クリックして画像の名前を付けて保存します。これにより、ZIP ファイル内のすべてのポイントを保存できます。まず、4DXイメージファイルを開きます。
画像をスタックで開くかどうかを尋ねるポップアップウィンドウが表示されます。[OK] をクリックします。次に、[イメージ]、[スタック]、[Z プロジェクト] を選択して、[Z 投影] ウィンドウを開きます。最初から最後のスライスまでのすべてのスライスを含めます。
[投影タイプ]で[最大強度]が選択されていることを確認し、[OK]をクリックします。Z プロジェクトを含む新しいウィンドウをクリックします。画像、色、スプリットチャンネルを選択し、IBA1チャンネルの画像にトレースを実行します。メニューバーで、分析、測定の設定を選択します。
エリア、中心点、周囲を確認します。[リダイレクト先] ドロップダウン メニューで、開いているファイルを選択し、[OK] をクリックします。イメージに刻印された縮尺に基づいて手動で尺度を設定するには、[直線] ツールを選択します。スケールの端にカーソルを置き、Shift キーを押しながら、イメージ上のスケールにできるだけ近い線を描画します。
[分析]、[尺度の設定] の順に選択します。ウィンドウがポップアップします。正しい既知の距離と長さの単位を入力して、長さごとのピクセル単位を決定し、[OK]をクリックします。IBA1チャネルの相馬サイズを測定するには、フリーハンド選択ツールで相馬の大まかな周囲を描きます。
ツールバーの [楕円] ツールをダブルクリックして、選択ブラシ ツールを有効にします。[選択ブラシを有効にする]ボックスがオンになっていることを確認し、[OK]をクリックします。選択ブラシを使用して、ソーマに最適なトレースを調整します。ズームインすると、このステップの間に精度が有効になります。
次に、T キーを押して、ソーマ トレースを ROI マネージャに追加します。[分析]、[測定]を選択するか、M キーを押して結果を表示します。これらの結果をコピーしてデータシートに貼り付けます。
ROI マネージャ ウィンドウに移動し、対象の地域を選択し、[名前の変更] をクリックしてイメージの名前に一致するように名前を変更します。名前を変更したリージョンを右クリックし、[保存]をクリックします。名前が、トレースがソーマ用であることを指定し、ファイルを保存することを確認します。
IBA1 チャネルのアーバライゼーション領域を測定するには、まずポリゴン選択ツールを選択します。ツールでマイクログリアプロセスの四肢をクリックしてポリゴンシェイプを開始します。各プロセスの先端をクリックしてミクログリアを回り、マイクログリアの樹状化で覆われた領域を最もよく表すポリゴンを形成します。
ポリゴンが完成したら、始点をクリックして閉じます。次に、T キーを押して、トレースを ROI マネージャに追加します。[分析]、[測定]を選択するか、Mキーを押して、データを結果ウィンドウに追加します。
このデータをコピーして、データシートに貼り付けます。樹状化領域に関する情報を保存するには、ROI マネージャ ウィンドウに移動し、対象の領域を選択し、名前を変更して、イメージの名前に一致するように変更します。名前を変更したリージョンを右クリックし、[保存]をクリックします。
名前で、トレースがアーバーリゼーション用であることを指定し、ファイルを保存してください。本研究では、IBA1とTMEM119の免疫蛍光共染色と、マウス脳組織における微小グリア密度、分布および形態、ならびに末梢骨髄細胞浸潤の分析のためのステップバイステップのワークフローについて説明した。蛍光顕微鏡は、20倍の拡大で側海馬のコロナ部でIBA1とTMEM119を使用してミクログリアの共標識を画像化するために使用されます。
成功した染色は、微小グリア細胞体とその微細なプロセスを明らかにします。染色により、ミクログリア密度と分布の決定と、ミクログリアクラスターの同定とマクロファージの浸潤が可能になります。共焦点顕微鏡は、40倍倍の段階的な微小合合部の集水追跡手順を画像化するために使用されます。
これらの代表的な結果は、IBA1陽性およびTMEM119陽性ミクログリアならびに細胞体トレースの例を示す。細胞を数えるときに一貫性を持ち、IBA1とTMEM119の両方の信号に注意を払うことが重要です。この技術は、研究者が補完的な技術でより詳細に研究することができる特定の刺激によって影響を受ける脳の領域を識別することができます。
