Это видео предоставит подробные протоколы для экспериментов в форме in vitro, чтобы определить вторичную структуру РНК последовательностей, представляющих интерес в присутствии РНК ориентации малых молекул. Форма in vitro является экономически эффективным методом для понимания динамики каждого нуклеотида на аминокислотном РНК-элементе, который обычно составляет менее 200 нуклеотидов. После подготовки шаблона РНК, как описано в рукописи, радио этикетка обратной транскрипции грунтовки, добавив гамма 32P АТФ, обратная транскрипция грунтовки.
10XPNK буфер реакции, полинуклеотид киназы и свободной воды РНК в 1,7 миллилитров микроцентрифуг трубки в общем объеме 20 микролитров. Затем инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа. Затем вы активируете образцы в течение 20 минут с 65 градусов по Цельсию, а затем фильтруете образцы в колонке для опреснировки и центрифуге в 1000 раз G.Add 25 микролитров буфера и смеси образца мочевины 2XTBE.
Опустите эти маркированную продукцию в гель 10%acrylamide и убеждайтесь во избежание кровотечение радиоактивность в верхние резервуары. Вы запустите гель на 20 Вт в течение одного часа. После пробежки снимите стеклянные пластины гелеобразной кассеты.
Положите гель на кусок полиэтиленовой пленки. Сложите пластик на верхнюю часть геля, чтобы сделать герметичной бутерброд. Поместите гель сэндвич на кальций-вольфсударный фосфорный экран и разоблачить с воображая инструмент.
Изображение гель снова с регулярным светом, чтобы знать, где края геля. Используйте программное обеспечение для обработки изображений, чтобы наложить два изображения и наложить светлые и темные изображения. Затем сделайте верхнее изображение слегка непрозрачным, чтобы увидеть оба изображения одновременно.
Убедитесь, что печатное изображение имеет тот же размер, что и фактический гель. Затем выровняй гель на печатном изображении. Наконец, используйте стерилизованное лезвие бритвы, чтобы вырезать желаемые изгибы из геля и поместить каждый кусок геля в отдельную 1,7 миллилитровую микроцентрифугную трубку.
Чтобы восстановить ДНК из ломтика геля пассивным элюционом, добавьте 0,3 миллилитров смеси осадков elution в каждую 1,7 миллилитровую трубку. Инкубировать трубки в радиоактивно-безопасном контейнере на ротаторе при четырех градусах по Цельсию в течение 16 часов. После инкубации перенесите жидкость в новую 1,7 миллилитровую трубку.
Добавить 2.5x ледяной 200 доказательство этанола и инвертировать трубки шесть раз, чтобы смешать жидкость. Инкубировать трубки при температуре минус 80 градусов по Цельсию в течение как минимум одного часа. После центрифугирования при 10 000 г и 4 градусах Цельсия в течение 10 минут, удалите супернатант тщательно трубопроводом.
Добавьте один миллилитр 80% этанола для мытья гранул. Вихрь в течение 15 секунд и центрифуга снова в тех же условиях. После удаления супернатанта путем пипетки, воздух-сухой гранулы ДНК в течение пяти минут.
Добавьте 50 микролитров свободной воды РНК и смешайте с помощью трубок вверх и вниз 10 раз. Нормализация концентрации ДНК примерно до 100 000 кол-во в минуту на микролитер в счетчике сцинтилляции. Чтобы подготовить четыре образца для химической модификации, добавьте восемь пикомолов РНК в 32 микролитров буфера 0,5 XTE в 1,7 миллилитровую микроцентрифугную трубку.
Нагрейте при температуре 80 градусов по Цельсию в течение двух минут и оснастки прохладно на льду, по крайней мере одну минуту. Затем добавьте восемь микролитров 5x складной смеси, смешайте выделить девять микролитров этой смеси РНК в каждой из четырех труб ПЦР, помеченных от одного до четырех. Добавьте один микролитер 10%DMSO в трубку, помеченную как один, один микролитер концентрированного раствора малых молекул в трубку два, один микролитер разбавленного раствора малых молекул в трубку три и один микролитер воды в трубку четыре.
Инкубировать все ПЦР трубки при 37 градусах по Цельсию в тепловой циклер в течение 30 минут. Непосредственно перед двумя премьер OH модификации реакции, разбавить один микролитер из двух молярных NAI фондового раствора в трех микролитров DEPC-обработанной воды, чтобы дать 0,5 молярного рабочего решения. Сразу добавьте один микролитер этого раствора в трубки один, два и три.
Добавьте один микролитр 25%DMSO в трубку четыре и инкубировать в тепловой циклер при 37 градусах по Цельсию в течение 15 минут. Приготовьте четыре свежих 1,7 миллилитровых микроцентрифуговых трубки и добавьте 100 микролитров смеси осадков elution и два микролитера гликогена в каждую трубку. Затем в каждую из этих трубок передают всю жидкость из соответствующих ПЦР труб.
Добавьте 0,34 миллилитров ледяного этанола 200 в каждую трубку и смешайте вихрем в течение пяти секунд. Поместите трубки в морозильную камеру минус 80 градусов по Цельсию, по крайней мере один час. Затем центрифуга труб в течение 15 минут при 14000 раз G при четырех градусах Цельсия.
Не нарушая гранулы РНК, удалить супернатант из каждой трубки. Добавьте 0,5 миллилитров 80% этанола на трубку для мытья гранул РНК и вихря в течение 15 секунд. После центрифугирования в тех же условиях снова, удалить супернатант и высушить гранулы РНК в течение пяти минут.
Добавить девять микролитров свободной воды РНК и трубы, что вверх и вниз 10 раз, чтобы смешать. Перенесите модифицированную РНК в четыре новые трубки ПЦР и обозначите их от одного до четырех, как на предыдущем этапе. Добавьте два пикомолы РНК в семь микролитров воды, обработанной DEPC, к каждой из четырех дополнительных трубок ПЦР и обозначите их цифрами от пяти до восьми.
Добавьте два микролитров восстановленной радиозамещенной грунтовки к каждой из восьми трубок ПЦР, отмеченных от одного до восьми. После нагрева при 65 градусах по Цельсию в течение пяти минут, сразу же остыть до четырех градусов по Цельсию в тепловой циклер. Добавьте четыре микролитров буфера 5x RT, один микролитр 0,1 молярного DTT и один микролитр смеси DNTP к каждой из трубок.
Затем добавьте два микролитров воды, обработанной DEPC, в трубки от одного до четырех. Добавьте четыре микролитера из пяти миллимоляров ddATP в трубку пять, четыре микролитера из пяти миллимолейных ddTTP в трубку шесть и четыре микролитера из пяти миллимолейных ddCTP в трубку семь и один микролитр из пяти миллимолейных ddGTP и три микролитров DEPC-обработанной воды в трубку восемь и пипетку четыре раза, чтобы смешать. После нагрева всех труб ПЦР при 52 градусах Цельсия в течение одной минуты в тепловом циклере, добавьте один микролитр обратной транскриптазы к каждой трубке и трубы его вверх и вниз четыре раза, чтобы смешать.
Инкубировать реакции при 52 градусах по Цельсию в течение 20 минут в тепловом циклере. Для гидролиза РНК добавьте в каждую из труб один микролитер из пяти гидроксида натрия моляра и нагревайте их при температуре 95 градусов по Цельсию в течение пяти минут. Затем добавьте пять микролитров одной молярной соляной кислоты, чтобы нейтрализовать реакцию и повторить осадки этанола, как описано ранее.
После высыхания воздуха гранулы ДНК в течение пяти минут, добавить 10 микролитров воды и 10 микролитров 2xTBE мочевины образца загрузки буфера в 1,7 миллилитров труб и трубы его вверх и вниз в 10 раз, чтобы переостереть. Нагрейте образцы при температуре 70 градусов по Цельсию в течение пяти минут, затем поместите трубки на лед, перед загрузкой на гель. Загрузите 10 микролитров образца, которые были помещены на лед, на 8%полиакриламида секвенирования геля.
Вы запустите гель на 65 Вт в течение двух часов или до тех пор, пока нижний краситель достигает 3/4ths геля. Снимите промявитель и аккуратно вставьте шпатель, чтобы удалить верхнюю силиконовую стеклянную пластину. Обложка гель с куском большой фильтровальной бумаги и осторожно нажмите, чтобы гель придерживаться фильтровальной бумаги.
Начиная с нижней части, поднимите фильтровальную бумагу и удалите гель из стеклянной пластины вместе с бумагой. После передачи геля на оберточную бумагу, как это было сделано ранее, высушите его при 70 градусах по Цельсию в течение одного часа с вакуумом, убедившись, что использовать несколько фильтровальной бумаги между гелем и сушилкой. Перенесите сэндвич с гелем на кассету с экраном хранения фосфора с фото отбеленным и подвергните радиоактивность геля экрану в течение четырех-16 часов.
Наконец, поместите экран хранения фосфора на устройство визуализации и сканируйте со средним разрешением в течение примерно 30 минут. После разоблачения полиакриламида секвенирования геля на экран хранения фосфора, успешный эксперимент формы показал один и наиболее интенсивный изгиб в верхней части геля и изгибы по всему гель в одном нуклеотидного разрешения без мазка. Гель также показал, что интенсивность некоторых изгибов изменяется в присутствии мелких молекул, что указывает на изменения силы базового спаривания.
Распространенной проблемой в анализе страниц является то, что область мазка, известная как солевой фронт, может появиться в середине геля, вероятно, из-за высокой концентрации соли, DMSO или другого нежелательного вещества в образце загрузки. Этого можно избежать, удалив нежелательное вещество с помощью этанола осадков. Однородный шаблон РНК предпочтительнее формы in vitro.
Мы используем рибосомы на обоих пяти премьер и три основных концов, чтобы получить такую РНК. Форма клетки также может быть выполнена для получения вторичной структуры РНК в клеточном контексте. Помните, что форма in vitro не может резюмировать взаимодействия белка, связывающего виво РНК.
Форма in vitro является мощным методом обнаружения изменений в структуре РНК из-за присутствия небольшой молекулы. Это делается путем количественной оценки изменений в структуре силы обратной транскрипции останавливается. Будьте осторожны, чтобы все эксперименты, описанные в этом видео, проводились на разрешенном радиоактивном рабочем месте с соответствующей личной защитой и защитой плексигласа.
