Bu video, küçük bir molekülü hedefleyen bir RNA'nın varlığındaki ilgi rna dizilerinin ikincil yapısını belirlemek için in vitro şekil deneyleri için ayrıntılı protokoller sağlayacaktır. İn vitro şekil genellikle 200 nükleotit daha az bir amino boyutlu RNA elementi üzerinde her nükleotit dinamiklerini anlamak için uygun maliyetli bir yöntemdir. El yazmasında açıklandığı gibi RNA şablonu hazırlandıktan sonra, bir gama 32P ATP ekleyerek radyo etiketi ters transkripsiyon astarlar, ters transkripsiyon astar.
10XPNK reaksiyon tamponu, polinükleotid kinaz ve RNA'nın serbest suyu 1.7 mililitrelik mikrosentrifüge tüpünde toplam 20 mikrolitre hacimdedir. Sonra bir saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yat. Daha sonra 65 santigrat derece beri 20 dakika boyunca örnekleri etkinleştirin ve daha sonra 1000 kez G.Add 25 mikrolitre 2XTBE üre örnek tampon ve mix bir tuzsuzluk sütun ve santrifüj örnekleri filtreleyin.
%10 akrilamid jel içine bu etiketli ürünleri düşürün ve üst rezervuarlar içine radyoaktivite kanama önlemek için emin olun. Bir saat boyunca 20 watt jel çalıştırın. Çalışmadan sonra jel kasetin cam plakalarını çıkarın.
Jeli plastik ambalajın üzerine ser. Bir hava geçirmez sandviç yapmak için jel üstüne plastik katlayın. Bir kalsiyum-tungstate fosfor ekran üzerine jel sandviç yerleştirin ve bir hayal aleti ile ortaya çıkarmak.
Jel kenarları nerede olduğunu bilmek için düzenli ışık ile tekrar jel görüntü. İki görüntüyü kaplamak ve açık ve koyu renkli görüntüleri kaplamak için bir görüntü işleme yazılımı kullanın. Daha sonra her iki görüntüyü aynı anda görmek için üstteki görüntüyü biraz opak hale getirin.
Yazdırılan görüntünün gerçek jelle aynı boyutta olduğundan emin olun. Daha sonra yazdırılan görüntüdeki jeli hizalayın. Son olarak, jel istenilen virajları kesmek ve jel ayrı bir 1.7 mililitre mikrosantrifüj tüp her parça yerleştirmek için sterilize jilet kullanın.
Pasif elüsasyon ile jel dilimden DNA kurtarmak için, her 1.7 mililitre tüp elüsyon yağış karışımı 0.3 mililitre ekleyin. Tüpleri radyoaktif güvenli bir kapta 16 saat boyunca dört derece santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra sıvıyı 1,7 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın.
2.5x buz soğuk 200 geçirmez etanol ekleyin ve sıvı karıştırmak için tüpleri altı kez ters çevirin. Tüpleri eksi 80 derecede en az bir saat kuluçkaya yatırın. 10 dakika boyunca 10, 000g ve dört santigrat derece santrifüj sonra, pipetleme tarafından dikkatle supernatant çıkarın.
Pelet yıkamak için% 80 etanol bir mililitre ekleyin. Girdap 15 saniye ve santrifüj tekrar aynı koşullar altında. Supernatant'ı pipetleme ile çıkardıktan sonra, DNA peletini beş dakika havayla kurutun.
RNA'nın serbest suyunun 50 mikrolitresini ekleyin ve 10 kez yukarı ve aşağı borular ekleyerek karıştırın. Bir sintillation sayacında mikrolitre başına dakikada 100,000 sayıma kadar DNA konsantrasyonunu normalleştirin. Kimyasal modifikasyon için dört numune hazırlamak için, 1,7 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne 0,5 XTE tamponunun 32 mikrolitresinde sekiz adet RNA pikomolekleyin.
Isı 80 santigrat derecede iki dakika ve en az bir dakika buz üzerinde serin snap. Sonra 5x katlama karışımı sekiz mikrolitre ekleyin, dört PCR tüpleri her içine bu RNA karışımı bir tahsis dokuz mikrolitre karıştırın, bir ila dört etiketli. Bir olarak işaretlenmiş tüpiçine% 10 DMSO bir mikrolitre ekleyin, tüp içine konsantre küçük molekül çözeltisi bir mikrolitre, tüp içine seyreltilmiş küçük molekül çözeltisi bir mikrolitre üç ve tüp dört içine su bir mikrolitre.
Tüm PCR tüplerini 37 santigrat derecede bir termal döngüde 30 dakika kuluçkaya yatırın. İki ana OH modifikasyon reaksiyonundan hemen önce, 0,5 molar çalışma çözeltisi vermek için depc ile işlenmiş üç mikrolitre de iki molar NAI stok çözeltisinin bir mikrolitresini seyreltin. Hemen tüpler bir, iki ve üç içine bu çözeltinin bir mikrolitre ekleyin.
Tüp dört içine% 25 DMSO bir mikrolitre ekleyin ve 15 dakika boyunca 37 derece santigrat bir termal döngü içinde kuluçka. Dört taze 1.7 mililitre mikrosantrifüj tüp hazırlayın ve her tüpe 100 mikrolitre elüsyon çökeltme karışımı ve iki mikrolitre glikojen ekleyin. Daha sonra bu tüplerin her biri içine ilgili PCR tüpleri tüm sıvı transferi.
Her tüp içine buz gibi 200 geçirmez etanol 0,34 mililitre ekleyin ve beş saniye girdap tarafından karıştırın. Tüpleri eksi 80 derecelik dondurucuya en az bir saat yerleştirin. Sonra tüpleri 14,000 kez G'de 15 dakika santrifüj edin.
RNA peletini rahatsız etmeden, her tüpten süpernatantı çıkarın. 15 saniye boyunca RNA pelet ve girdap yıkamak için tüp başına% 80 etanol 0,5 mililitre ekleyin. Tekrar aynı koşullarda santrifüj sonra, supernatant çıkarın ve hava-rna pelet beş dakika kuru.
RNA'nın serbest su ve boru dokuz mikrolitre ekleyin yukarı ve aşağı 10 kez karıştırmak için. Modifiye Edilmiş RNA'yı dört yeni PCR tüpüne aktarın ve önceki adımda olduğu gibi 1-4 etiketleyin. Dört ek PCR tüpünün her birine yedi mikrolitre DEPC ile işlenmiş suya iki adet RNA pikomolü ekleyin ve bunları beş ila sekiz arasında sayılarla etiketleyin.
Bir ila sekiz arasında işaretlenmiş sekiz PCR tüpünün her birine, kurtarılan radyoetiketli astarın iki mikrolitresini ekleyin. 5 dakika boyunca 65 santigrat derecede ısıtılmasından sonra, termal döngüde hemen 4 santigrat dereceye kadar soğuyun. Tüplerin her birine 5x RT tamponunun dört mikrolitresini, bir mikrolitre0 0,1 molar DTT ve bir mikrolitre DNTP karışımıekleyin.
Daha sonra tüplere 1-4 depc ile işlenmiş iki mikrolitre su ekleyin. Tüp beş beş milimolar ddATP dört mikrolitre ekleyin, beş milimolar ddTP beş milimolar ddCTP dört mikrolitre tüp yedi ve beş milimolar ddGTP bir mikrolitre ve tüp sekiz ve pipet dört kez karıştırmak için DEPC ile tedavi su üç mikrolitre. Bir termal döngüiçinde bir dakika boyunca 52 santigrat derecede tüm PCR tüpleri ısıtma sonra, her tüp için ters transkriptaz bir mikrolitre ekleyin ve karıştırmak için dört kez yukarı ve aşağı boru.
Reaksiyonları 52 derecede, termal döngüde 20 dakika kuluçkaya yatırın. RNA'yı hidrolize etmek için, tüplerin her birine beş molar sodyum hidroksit in bir mikrolitre ekleyin ve onları 95 derecede beş dakika ısıtın. Daha sonra reaksiyonu nötralize etmek ve daha önce açıklandığı gibi etanol yağışı tekrarlamak için bir molar hidroklorik asit beş mikrolitre ekleyin.
DNA peletini beş dakika hava kuruttuktan sonra, 1,7 mililitrelik tüplerde 10 mikrolitre su ve 10 mikrolitre 2xTBE üre numune yükleme tamponu ekleyin ve 10 kez yeniden çözünmek için borulayın. Numuneleri 70 derecede beş dakika ısıtın, sonra jelüzerine yüklemeden önce tüpleri buza yerleştirin. Buz üzerine yerleştirilen numunenin 10 mikrolitresini %8 poliakrilamid sıralama jeline yükleyin.
Jeli 65 watt'ta iki saat veya alt boya jelin üçte biri olana kadar çalıştırın. Spacer çıkarın ve yavaşça üst silikoncam plaka kaldırmak için bir spatula takın. Jeli büyük bir filtre kağıdı ile kaplayın ve jelin filtre kağıdına yapışmasını sağlamak için hafifçe bastırın.
Alt uçtan başlayarak, filtre kağıdını kaldırın ve jeli kağıtla birlikte cam plakadan çıkarın. Daha önce yapıldığı gibi bir ambalaj kağıdına jel aktardıktan sonra, bir vakum ile bir saat boyunca 70 derece santigrat kuru, jel ve kurutucu arasında birkaç filtre kağıtları kullandığınızdan emin olun. Jel sandviçi fotoğrafla beyazlatılmış fosfor saklama ekranı kasetine aktarın ve jelin radyoaktivitesini 4 ila 16 saat boyunca ekrana takın.
Son olarak, fosfor depolama ekranını bir görüntüleme cihazına yerleştirin ve yaklaşık 30 dakika orta çözünürlükte tarayabilirsiniz. Fosfor depolama ekranına poliakrilamid sıralama jelmaruz kaldıktan sonra, başarılı bir şekil deneyi jel üstünde tek ve en yoğun viraj gösterdi ve yayma olmadan tek nükleotit çözünürlükte jel boyunca virajlı. Jel ayrıca bazı bükümlerin yoğunluğunun küçük moleküllerin varlığında değiştiğini gösterdi, bu da baz eşleştirme mukavemetinin değiştiğini gösteriyordu.
Sayfa analizinde sık karşılaşılan bir sorun, tuz cephesi olarak bilinen bir yayma bölgesinin jelin ortasında, muhtemelen yükleme numunesindeki yüksek tuz konsantrasyonu, DMSO veya diğer istenmeyen maddeler nedeniyle ortaya çıkmasıdır. Bu etanol yağış ile istenmeyen madde kaldırarak önlenebilir. Homojen Bir RNA şablonu in vitro şekil için tercih edilir.
Biz böyle bir RNA elde etmek için hem beş asal ve üç prime ucunda ribozomlar kullanın. Hücre içi şekil de hücresel bağlamda RNA ikincil yapısı elde etmek için yapılabilir. Unutmayın, in vitro şekil in vivo RNA bağlayıcı protein etkileşimleri recapitulate olmayabilir.
In vitro şekil küçük bir molekülün varlığı nedeniyle RNA yapısındaki değişiklikleri tespit etmek için güçlü bir yöntemdir. Bu ters transkriptaz durur desenleme gücü değişiklikleri ölçülmesi ile yapılır. Bu videoda açıklanan tüm deneylerin uygun kişisel koruma ve pleksiglas kalkanlı yetkili bir radyoaktif işyerinde yapılmasına karşı dikkatli olun.
