Este vídeo fornecerá protocolos detalhados para experimentos de forma in vitro para determinar a estrutura secundária de sequências de RNA de interesse na presença de um RNA direcionado a pequenas moléculas. A forma in vitro é um método econômico para entender a dinâmica de cada nucleotídeo em um elemento RNA do tamanho de amino, que geralmente é inferior a 200 nucleotídeos. Depois de preparar o modelo de RNA como descrito no manuscrito, primers de transcrição reversa de rótulo de rádio adicionando um ATP gama 32P, primer de transcrição invertida.
Tampão de reação 10XPNK, quinase de polinucleotídeo e água livre do RNA em um tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitro em um volume total de 20 microlitures. Em seguida, incubar a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, ative as amostras por 20 minutos a partir de 65 graus Celsius e, em seguida, filtrar as amostras em uma coluna de dessatar e centrífuga a 1000 vezes G.Adicione 25 microliters de 2XTBE ure sample buffer e mix.
Abaixe esses produtos rotulados em um gel de acrilamida de 10% e certifique-se de evitar sangrar a radioatividade nos reservatórios superiores. Execute o gel a 20 watts por uma hora. Após a corrida, remova as placas de vidro do de gel.
Coloque o gel no pedaço de plástico. Dobre o plástico na parte superior do gel para fazer um sanduíche com ar apertado. Coloque o sanduíche de gel em uma tela de fósforo de cálcio e exponha com um instrumento de imaginação.
Imagem do gel novamente com luz regular para saber onde estão as bordas do gel. Use um software de processamento de imagem para sobrepor as duas imagens e sobrepor as imagens claras e escuras. Em seguida, faça a imagem superior ligeiramente opaca para ver ambas as imagens simultaneamente.
Certifique-se de que a imagem impressa tenha o mesmo tamanho do gel real. Em seguida, alinhe o gel na imagem impressa. Por fim, use uma lâmina de barbear esterilizada para cortar as curvas desejadas do gel e coloque cada pedaço de gel em um tubo de microcentrifuge separado de 1,7 mililitro.
Para recuperar o DNA da fatia de gel por eluição passiva, adicione 0,3 mililitros de mistura de precipitação de eluição a cada tubo de 1,7 mililitro. Incubar os tubos em um recipiente de segurança radioativa em uma rotadora a quatro graus Celsius por 16 horas. Após a incubação, transfira o líquido para um novo tubo de 1,7 mililitro.
Adicione 2,5x de etanol gelado 200 à prova e inverta os tubos seis vezes para misturar o líquido. Incubar os tubos a menos 80 graus Celsius por um mínimo de uma hora. Depois de centrifugar a 10.000g e quatro graus Celsius por 10 minutos, remova o sobrenatante cuidadosamente por pipetação.
Adicione um mililitro de 80% de etanol para lavar a pelota. Vórtice por 15 segundos e centrífuga novamente sob as mesmas condições. Depois de remover o supernatante por pipetação, seque a pelota de DNA por cinco minutos.
Adicione 50 microliters da água livre do RNA e misture por tubulação para cima e para baixo 10 vezes. Normalize a concentração de DNA para cerca de 100.000 contagens por minuto por microliter em um balcão de cintilação. Para preparar quatro amostras para modificação química, adicione oito picomoles de RNA em 32 microliters de 0,5 XTE tampão a um tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitro.
Aqueça a 80 graus Celsius por dois minutos e esfrie no gelo por pelo menos um minuto. Em seguida, adicione oito microliters de mistura dobrável de 5x, misture nove microliters desta mistura de RNA em cada um dos quatro tubos PCR, rotulados de um a quatro. Adicione um microliter de 10% DMSO no tubo marcado como um, um microliter de solução concentrada de pequenas moléculas no tubo dois, um microliter de solução de molécula pequena diluída no tubo três e um microliter de água no tubo quatro.
Incubar todos os tubos PCR a 37 graus Celsius em um cicloviário térmico por 30 minutos. Logo antes da reação de modificação oh principal, diluir um microliter de duas soluções molar nai em três microliters de água tratada com DEPC para produzir uma solução de trabalho molar 0,5. Adicione imediatamente um microliter desta solução nos tubos um, dois e três.
Adicione um microliter de 25% DMSO no tubo quatro e incubar em um cicloviário térmico a 37 graus Celsius por 15 minutos. Prepare quatro tubos frescos de microcentrífa de 1,7 mililitro e adicione 100 microliters de mistura de precipitação de eluição e dois microliters de glicogênio a cada tubo. Em seguida, em cada um desses tubos transfira todo o líquido dos tubos PCR correspondentes.
Adicione 0,34 mililitros de etanol à prova de gelo 200 em cada tubo e misture por vórtice por cinco segundos. Coloque os tubos em um congelador de menos 80 graus Celsius por pelo menos uma hora. Em seguida, centrifugar os tubos por 15 minutos a 14.000 vezes G a quatro graus Celsius.
Sem perturbar a pelota de RNA, remova o supernatante de cada tubo. Adicione 0,5 mililitros de 80% de etanol por tubo para lavar a pelota de RNA e o vórtice por 15 segundos. Depois de centrifuging nas mesmas condições novamente, remova o sobrenasce e seque a pelota de RNA por cinco minutos.
Adicione nove microliters de água livre do RNA e tubo que sobe e desce 10 vezes para misturar. Transfira o RNA modificado para quatro novos tubos PCR e rotule-os de um a quatro como na etapa anterior. Adicione dois picomoles de RNA em sete microliters de água tratada com DEPC a cada um dos quatro tubos pcr adicionais e rotule-os com números de cinco a oito.
Adicione dois microliters do primer radiolabeled recuperado a cada um dos oito tubos PCR marcados de um a oito. Depois de aquecer a 65 graus Celsius por cinco minutos, esfrie imediatamente até quatro graus Celsius no cicloviário térmico. Adicione quatro microliters de tampão 5x RT, um microliter de 0,1 molar DTT e um microliter de mistura DNTP a cada um dos tubos.
Em seguida, adicione dois microliters de água tratada com DEPC aos tubos de um a quatro. Adicione quatro microliters de cinco mililitros ddATP ao tubo cinco, quatro microliters de cinco mililitros ddTTP ao tubo seis e quatro microliters de cinco milimolar ddCTP ao tubo sete e um microliter de cinco mililitros ddGTP e três microliters de água tratada de DEPC para tubo oito e pipeta quatro vezes para misturar. Depois de aquecer todos os tubos PCR a 52 graus Celsius por um minuto em um ciclor térmico, adicione um microliter de transcriptase reversa a cada tubo e tubo-o para cima e para baixo quatro vezes para misturar.
Incubar as reações a 52 graus Celsius por 20 minutos no cicloviário térmico. Para hidrolisar o RNA, adicione um microliter de cinco hidróxido de sódio molar em cada um dos tubos e aqueça-os a 95 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, adicione cinco microliters de um ácido clorídrico molar para neutralizar a reação e repetir a precipitação do etanol como descrito anteriormente.
Depois de secar o dna por cinco minutos, adicione 10 microlitres de água e 10 microlitres de 2xTBE ureia amostra de 3000 em tubos de 1,7 mililitros e tubo-lo para cima e para baixo 10 vezes para redissolve. Aqueça as amostras a 70 graus Celsius por cinco minutos, depois coloque os tubos no gelo, antes de carregar no gel. Carregue 10 microliters da amostra que foi colocada no gelo em gel de sequenciamento de poliacrilamida de 8%.
Execute o gel a 65 watts por duas horas ou até que o corante inferior atinja os 3/4 do gel. Remova o espaçador e insira delicadamente uma espátula para remover a placa de vidro silicone superior. Cubra o gel com um pedaço de papel filtro grande e pressione suavemente para permitir que o gel adere ao papel do filtro.
A partir da extremidade inferior, levante o papel do filtro e remova o gel da placa de vidro junto com o papel. Depois de transferir o gel para um papel de embrulho como feito anteriormente, seque-o a 70 graus Celsius por uma hora com um vácuo, certificando-se de usar vários papéis de filtro entre o gel e a secadora. Transfira o sanduíche de gel para um de tela de armazenamento de fósforo foto-branqueado e exponha a radioatividade do gel para a tela por quatro a 16 horas.
Por fim, coloque a tela de armazenamento de fósforo em um dispositivo de imagem e escaneie com resolução média por aproximadamente 30 minutos. Depois de expor o gel de sequenciamento de poliacrilamida à tela de armazenamento de fósforo, um experimento de forma bem sucedido mostrou uma única e mais intensa curva na parte superior do gel e dobra ao longo do gel em resolução de nucleotídeo único sem difamação. O gel também mostrou que a intensidade de algumas curvas mudou na presença de pequenas moléculas, indicando mudanças na força de emparelhamento da base.
Um problema comum na análise da página é que uma região de difamação conhecida como frente de sal pode aparecer no meio do gel, provavelmente devido à alta concentração de sal, DMSO ou outra substância indesejada na amostra de carregamento. Isso pode ser evitado removendo a substância indesejada por precipitação de etanol. Um modelo de RNA homogêneo é preferível para forma in vitro.
Usamos ribossomos em cinco prime e três extremidades primos para obter tal RNA. A forma em células também pode ser realizada para obter estrutura secundária de RNA no contexto celular. Lembre-se, a forma in vitro pode não recapitular interações proteicas de ligação vivo RNA.
A forma in vitro é um método poderoso para detectar alterações na estrutura do RNA devido à presença de uma pequena molécula. Isso é feito quantificando mudanças na força de padronização das paradas de transcriptase reversa. Tenha cuidado para que todos os experimentos descritos neste vídeo sejam realizados em um local de trabalho radioativo autorizado com proteção pessoal adequada e blindagem de plexiglass.
