この方法は、新たに合成されたRNAをこのような短い時間スケールで分析することを可能にするプロトコルがなく、そのような短いパルスでパルスチェイス実験を可能にするため、重要です。このプロトコルは、ベストエイド4Uプロトコルなどのタンパク質枯渇に適しています。主な利点は、背景が低いということです。
これは、ほぼすべての非thiolated RNAを除去することによって、短い標識時間を可能にする。また、このプロトコルでは、実行できるさまざまな種類の実験と、それらをこの手法に統合する方法についても詳しく説明しています。この手順を開始するには、YMM培地で酵母を0.6と0.8の間のOD 600に成長させます。
ヒュームフードに、目的のサンプル量の30〜50%に相当するメタノールを50ミリリットルチューブに加えます。チューブをしっかりと閉じ、ラベルを付け、ドライアイスの上に置いて冷やします。次に、サンプルの長期保存のために2ミリリットルのチューブにラベルを付け、冷却するために氷の上に置きます。
2ミリリットルのチューブにジルコニアビーズを追加します。氷の上のサンプルあたり少なくとも1ミリリットルの水を冷却します。S.pombeスパイクを培養物に添加する場合は、チオラ化されたS.pombe細胞のアリコートを氷の上に置いて解凍します。
解凍されたアリコートを渦に入れ、文化に加えます。その後、培養物に4tUを10マイクロモルの濃度に加え、激しく混ぜます。15秒から5分の間の時間の長さのチオラベル。
時間コースの終わりまで一定の間隔で文化のサンプルを取ります。各サンプルを、メタノールを含む調製された遠心管の1つに加えます。各チューブを密封し、十分に混ぜ合わせて振り、ドライアイスの上に置きます。
すべてのサンプルが採取されたら、それらをすべて氷の上に置きます。いずれのサンプルも凍結されていないことを確認します。凍った方は、絶えず逆に手でやさしく温めます。
細胞を3,000倍gで遠心し、摂氏4度で2分間ペレットします。液体を注ぎ、ペレットを少なくとも1ミリリットルの氷冷水に入れ、上下に激しくピペットを入れます。準備されたスクリューキャップチューブにサスペンションを移し、チューブを氷の上に置きます。
サンプルを13,000グラムを超える速度で短時間遠心し、細胞を再ペレット化する。その後、氷の上に戻し、液体を取り除きます。まず、400マイクロリットルのAEバッファー、40マイクロリットルのSDS、および800マイクロリットルのフェノールを低pHで加えます。
10 秒間ボルテックスで再中断します。その後、最も低い電力設定で3つの2分間のバーストのためにホモジナイザーで細胞をlyseします。均質化パルスの間に2分間氷の上にサンプルを残します。
溶かした細胞を固まるまで5分間ドライアイスの上に置きます。次に、マイクロ遠心分離機を使用して、室温で5分間13,000回以上gの速度で細胞を回転させます。この後、テキストプロトコルで概説したように、フェノールクロロホルム抽出およびクロロホルム抽出を行う。
10モルクロリトの体積の1/3〜1/2の間に加え、混合してRNAを沈殿します。5分間13,000回以上の速度で遠心分離機。流体を取り除き、サンプルを一時的に再スピンしてドレッグを取り除きます。
その後、ペレットを70%エタノールの300~500マイクロリットルで洗浄する。洗浄したペレットを短く遠心分離し、残ったエタノールを除去する。振りながら摂氏65度で加熱して、90マイクロリットルのTEでRNAペレットをpH 7.0で再溶解します。
完全なRNA可溶化を確認した後、懸濁液を0.2ミリリットルチューブに移します。まず、10マイクロリットルのHPDP-ビオチン溶液をRNAに添加してビオチン化し、十分に混合します。暗闇の中で摂氏65度で15~30分インキュベートします。
次に、少量の樹脂容積、サイズ除外カラムを用意し、非法人ビオチンを除外する。柱の底部タグを取り外し、キャップを緩め、2 ミリリットルの遠心管にカラムを入れる。遠心分離機を1,500回gで1分間バッファを洗い流し、フロースルーを破棄する。
その後、静かに列の上部にTEの0.3ミリリットルを追加し、同じ条件を使用して再び回転します。洗浄したカラムを1.5ミリリットルの新鮮なチューブに移します。サンプルインキュベーションが完了したら、カラムの上部にサンプルを追加します。
1,500回gで遠心分離機を2分間、ビオチン化RNAサンプルをチューブの底に残した。列を破棄します。そして、試料を含むチューブに10モルクロリチの1/3~1/2体積を加えます。
混合してRNAを再沈殿します。まず、200マイクロリットルのDEPC処理水にRNAを再溶解する。RNA濃度を測定し、すべてのサンプルに対して同量のRNAを与える各サンプルの体積を計算します。
この量のRNAを新鮮なチューブに加え、DEPC処理水を合計容量200マイクロリットルまで添加します。試料が室温の場合は、10 x NaTMバッファーの25マイクロリットル、リン酸ナトリウム1モル25マイクロリットル、10%SDSの2.5マイクロリットルを加えます。十分に混ぜ合わせ、約100倍gで30秒未満で遠心分離機を軽く混ぜます。
1 つの x NaTM バッファー、0.1 モルリン酸ナトリウム、および 0.1%SDS を使用して、各サンプルに 2 ミリリットルのビーズ バッファーを準備します。ストレプトアビジンビーズ50マイクロリットルを低保持1.5ミリリットルチューブに加えます。チューブを磁気ラックに置き、ビーズが落ち着くのを待ちます。
その後、吸引によって流体を除去する。ビーズを洗浄するには、ビーズペレットが完全に再懸濁されるまで、200ミリリットルのビーズバッファーと渦を加えます。チューブを約100倍gで最大5秒間遠心分離する。
マグネットラックにチューブを置き、ビーズを磁石で取り込みます。サンプル数が少ない場合は吸引によって流体を除去します。多くのサンプルがある場合は、流体を注ぎ、その後吸引します。
200マイクロリットルのビーズバッファー、10マイクロリットルのグリコーゲン、2.5マイクロリットルのtRNAをブロックします。室温で20分間インキュベートし、終わりを適度な速度で回転させます。この後、流体を取り除き、テキストプロトコルで概説されているように、もう一度洗います。
サンプル中のビーズを再懸濁し、回転しながら室温で30分間インキュベートする。このインキュベーションの間に、各サンプルのための新鮮な1.5ミリリットルの管を準備する。pH 5.3とグリコーゲンの20マイクログラムで酢酸3モルの1/10容量を追加します。
遠心分離機は約100倍gで3秒間行う。ビーズから非結合RNAを取り出し、テキストプロトコルに記載されているように洗浄します。RNAを溶出するには、作りたての0.7モルベータメルカプトエタノールをビーズに50マイクロリットル加えます。
ボルテックスと遠心分離の後、スラリーを磁気ラックに入れる。調製した1.5ミリリットルの遠心分離管に溶液を含むRNAをピペット。前述のようにもう一度エルルート。
次に、サンプルを磁気ラックに戻して溶出したRNAから残留ビーズを取り除き、液体を新鮮で低結合の0.5ミリリットル遠心管に移します。サンプルを混ぜます。そして、2.5容量のエタノールを加え、nsRNAを沈殿させます。
混合およびインキュベート後、遠心分離機は少なくとも13,000回gの速度で、摂氏4度で20分間。このプロトコルを用いて回収されたsnRNAの典型的な収量を以下に示す。なお、ポイントゼロでのRNA回収は、約300億個の細胞から回収されたRNAのわずか0.3マイクログラムで、より長い時点から回収された部分のごく一部です。
しかし、わずか30秒の標識の後、同じ数の細胞から2倍以上のRNAが収集されます。バイオアナライザーのトレースでは、RNA前駆体は1,000ヌクレオチド付近のピークと1,700〜1,800ヌクレオチドのピークの二重と見なすことができます。これらの中間体の豊富さは、チオラクションが続くにつれて増加します。
次いで、チオ標識の開始から15秒間隔で採取されたサンプルでチオラ化が行われ、ACT1 RNA転写物の処理が監視されます。見られるように、プレmRNAおよびラリアットは、標識のわずか15秒後でも生成される。約45秒から1分後、ラリアットとプレmRNAの量は、スプライシングによって処理されるのと同じくらい転写によって作成されるこれらのRNA種の多くと均衡に達する。
最も困難なステップは、ビーズ、洗浄、およびブロッキングを含むステップです。ビーズを失わないように注意するか、それらを乾燥させてください。新しく合成したRNAを精製したら、従来のRNA分析手順を使用できます。
RNAは生体アナライザまたは類似の状態で実行することをお勧めします。その後、通常、QPCRとRNA-Seqを使用してRNAを分析します。この方法は、RNA処理の動態を分析するのに理想的であることが判明した。
最も危険なステップは、RNA抽出でフェノールとクロロホルムを使用するステップです。これらの化学物質を密封されていない容器に入れて使用するときは、フームフードで使用し、適切な防護服、ラボコート、手袋を着用してください。スクリューキャップチューブの糸にジルコニアビーズが入っていないので、漏れにつながるので、特に注意してください。
