これは、細胞に電気機械刺激を適用する方法です。細胞集団への影響を研究するための複数のアプリケーションを有し、生体内送達の事前トレーニング、および細胞成熟を行う。利点は、電気および機械的刺激は、無菌ウイルスをそのまま維持しながら、個別に、または同時に同じデバイスで適用することができるということです。
この技術は、私たちの治療への間接的なアプローチです。細胞療法は、電気機械的に刺激された細胞が、イントロ心筋を治療する興味深い細胞集団であり得る。この方法は一般的に心血管分野に属するが、神経系にも適用できる。
これは忍耐を必要とする簡単なテクニックです。最も困難な部分は、小片で作業し、全体の無菌性を保ちます。説明が難しい操作の詳細はほとんどないので、視覚的なデモンストレーションは本当に役に立ちます。
まず、12個の洗浄PDMSコンストラクトを無菌10センチメートルプレートに移すことから始めます。完全な滅菌を保証するために、プレートをUV光に5分間照射します。次に、各構成体を別々の35ミリメートルの細胞培養プレート、または6ウェルプレートに移して即時細胞播種を行います。
細胞の播種を開始するには、まず、1x PBSの5ミリリットルで心臓ATPPCのコンフルエントT75フラスコを洗浄します。細胞を取り外すには、0.05%トリプシン-EDTAの1ミリリットルを加えます。そして、5分間摂氏37度でインキュベートします。
その後、完全な培地を5ミリリットル加えてトリプシン-EDTAを不活性化する。15ミリリットルのチューブ内のすべての剥離細胞を収集します。残りの細胞を収集するためにPBSの5ミリリットルで細胞ガラスを2回洗浄し、15ミリリットルチューブに追加します。
摂氏22度で5分間230gで遠心分離機。上清を取り除き、完全な培地の2ミリリットルで細胞を再懸濁し、ヘモサイトメーターでそれらを数えます。PDMSを用いた各プレートに200マイクロリットルの心臓ATPCをシードし、翌日細胞で覆われた播種表面の約80%を得た。
摂氏37度、5%CO2でインキュベートします。プレートごとに温め込んだ完全な媒体を2ミリリットル軽く加えます。37°C、一晩で5%CO2で構築物で細胞をインキュベート。
この手順を開始する前に、電気機械刺激のための12の構造のうち6を割り当て、非刺激制御のために6を保つ。70%エタノールを使用して刺激ユニットを洗浄します。刺激装置、滅菌電極、ピンセットをフローキャビネットの内部に設置します。
電極および構成物を容易に操作するために、各細胞培養板から培地の90%を取り除く。PDMSの構成体を磁石の方向に正しい位置に配置して、固定磁石と移動磁石の両方の磁気的な魅力を保証します。この2つのステップでは、プロセス全体にわたって無菌性を保ちながら、細胞の播種PDMS構成体と電極を操作することが最も重要です。
次に、白金線を電極コネクタに接続します。PDMSコンストラクトの指定されたスペース内の電極のPTFE部分を向けます。各構成体に2.5ミリリットルの新鮮な、事前に温めた完全な媒体を加えます。
すべてのPDMS構成体を配置し、プラットフォームに電気的に接続したら、プラットフォームを摂氏37度、および5%CO2インキュベーターに戻します。次に、電気と機械のソースを接続します。刺激プログラムを構成するには、電気刺激装置のユーザーインターフェースと、機械的刺激を制御するアプリケーションを通じて、電気および機械刺激のレジームを指定します。
同期を設定するには、電気刺激装置のスイッチをオンにして、メインメニューがディスプレイに表示されるのを待ちます。次に、オプション 2 を選択し、シーケンスを編集し、Enter キーを押します。シーケンスメニューを編集するには、モードタブを使用して現在の「+」をクリックし、Enterキーを押して、期間 1000"をプラス/マイナスで選択し、Enterキーを押してトリガモードタブを選択し、外部を選択して[振幅]タブを押し、プラス/マイナスで1"を選択してEnterを押します。次に、メインメニューに戻り、オプション4を選択し、シーケンスを生成し、Enterキーを押します。
その後、ON時間テキストコントロールに500"と書き込み、機械的パルス持続時間を設定します。最後に、エクスカーションテキストコントロールに2000"と書き込み、10%の伸びを実現します。セルメディアを週に2回変更し、まず古いメディアを取り外し、次にPDMSサポートの側面に温かみのある新鮮なメディアを追加します。
7日目、実験の終わりに、原稿に記載されているサンプルを収集する。電気機械刺激心臓ATDPCは、心筋原性の可能性を高める。これは、心臓転写因子GATA-4、β-ミオシン重鎖の構造マーカー、およびカルシウム関連遺伝子Connexin43を特異的に早期および後期の心臓遺伝子の発現増加を示すリアルタイムPCRによって示された。
アクチン繊維に対するファロイジン染色は、大部分の細胞が垂直パターンに従って整列することを示した。Connexin43分布は、主に細胞質中で、そして形質膜において、ギャップ接合を通して細胞内コミュニケーションに寄与した。MEF2およびGATA-4転写因子は、心臓ADPCsの核に位置していた。
しかし、GATA-4は皮下ADPでは検出されなかった。細胞質マーカーSERCA2、および肉体α-アクチニンは、心筋細胞に典型的な成熟したサルコメア組織を示さなかった。そして、鼓動は対照的に観察されず、細胞集団を刺激した。
このプロトコルの開始時に健康な細胞単層と手順全体で無菌性を維持することは非常に重要です。サンプル採取後、標準ゲノムタンパク質発現技術を行うことができる。この技術は、細胞の電気的および/または機械的刺激の効果をよりよく理解するのに役立ちます。
最近まで、両方の刺激に同じデバイスを使用することは不可能だったので、結果を比較するのが難しくなりました。
