ライトの州立大学からの資金援助と忠所じゅ研究室のメンバーと思慮深い議論に感謝しています。

注: ここで説明されているプロトコル 10 96 ウェル プレートに含まれるライブラリ プラスミドをスクリーニングに最適ですが、スケールがアップまたはダウンします。プロトコルは、ライブラリ全体のスクリーニングを完了するために繰り返される必要があります。通常、1 人で毎回ライブラリの遺伝子の 10 皿に対してスクリーニングを快適処理できます。
1. 96 ウェル酵母の形質転換のための準備
注: この手順は記載されている7,10以前として行われます。
<ol><li>分注 5 μ L (約 50-100 ng) 丸底 96 ウェル プレートの各ウェルに配列したプラスミド ライブラリからの DNA のプラスミッドの。 注: このようなライブラリの例は酵母の遺伝子発現ライブラリ10になります。</li>
	<li>半数体酵母 W303α のコロニー (直径 2-3 mm) 500 mL フラスコ内の酵母ペプトン ブドウ糖 (YPD) メディアの 150 mL を接種します。一晩中揺れ (200 rpm) 30 ° C でそれらを孵化させなさい。</li>
	<li>次の朝、一晩かけて培養の OD600を測定し、外径600酵母培養を希釈 (まで) 2 l YPD の 0.1 を =。文化に達する外径 φ600まで 〜 5 h の, 振動 (200 rpm) 30 ° C で 0.4 – 0.6 を =。</li>
</ol>2. 酵母の形質転換
<ol><li>収穫 8 250 mL の滅菌遠心ボトルを充填し、それらを 3,000 x gで 10 分間、室温で遠心分離による酵母の培養はペレットを中断せず、上澄みを離れて注ぐ。 注: は、室温で遠心分離手順をすべてを実行します。</li>
	<li>洗浄滅菌蒸留 H2o. と酵母このため、追加 100 mL 滅菌 H2O の各遠心ボトルし、渦に細胞ペレットを再懸濁します。2 ボトルに遠心上清を注ぐ 3,000 x gで 5 分間で洗浄セルを結合します。</li>
	<li>各ボトル 100 mL に 0.1 M LiOAc/1XTE の (100 mM LiOAc; 10 mM トリス、pH 8.0; 1 mM EDTA) のセルを洗浄し、3,000 x gで 5 分間注ぐ、上澄みを離れてそれら遠心分離機します。</li>
	<li>遠心分離、100 ° C で 3 分間ブロック ヒーターを使用してのサケ精子 DNA (10 mg/mL) 5 mL を沸騰、アイスで冷却します。</li>
	<li>25 mL の 0.1 M LiOAc/1XTE 各ボトルでので細胞ペレットを再懸濁します、再懸濁のセルを結合して、150 mL のフラスコに転送します。予冷サケ精子 DNA の 5 mL を追加し、30 の ° c (225 rpm) を 30 分間振とうしながらインキュベートします。</li>
	<li>滅菌ディスポーザブル試薬リザーバーにセルを流し込むし、ライブラリ プラスミド DNA を含む丸底 96 ウェル プレートの各ウェルにセルの混合物の 35 μ L マルチ チャンネル ピペットを使用して、転送します。渦 96 ウェル プレート 1,000 rpm で 1 分の板 vortexer を使用します。振ることがなく 30 ° C で 30 分の版を孵化させなさい。 注: 熱がより効率的に移動することができますので、プレート、累積しません。我々 は、ボルテックス 1,000 rpm で 96 ウェルのプレートには、井戸の外に流出する液体を引き起こさないが、安全な渦の速度は、ステップを実行する前にテスト必要がありますを発見しました。</li>
	<li>フラスコで、200 mL の 40 %peg3350 の最終的な集中、10% DMSO 0.1 M LiOAc を含む変換バッファーを準備します。使用直前に変換バッファーを準備し、揺することによってそれを徹底的にミックスします。、</li>
	<li>30 の ° C の定温器からの削除 96年ウェル プレート 30 のためそれらをミックス プレート vortexer を使用して 1,000 rpm で s。1,000 rpm で 1 分間プレート各のよくし渦に変換バッファーの 125 μ L を追加します。</li>
	<li>30 ° C、30 分で版を孵化させなさいし、15 分の 42 ° C の定温器でプレートを配置することによってショック酵母を熱します。 注: は、プレートには累積しません。</li>
	<li>3,000 x gで 5 分間プレートを遠心します。井戸からゴミ箱にプレートを反転して強制的にプレートからバッファーをダンプ変換バッファーを削除します。すぐにしみのプレートの上に任意の液体を除去するきれいなペーパー タオルの上に倒立のプレート。</li>
	<li>ライブラリ プラスミッドの選択可能なマーカーに対応する最小ドロップ アウト中のプレート 200 μ L を追加することによって、細胞をすすいでください。 注意: 合成裏培地を使用しました。</li>
	<li>3,000 x gで 5 分間プレートを遠心し、ステップ 2.10 のようにゴミ箱の上清を除去します。</li>
	<li>最小限の裏メディア含む 2% ブドウ糖の 160 μ L を追加します。渦 1,000 rpm で 1 分板を振ることがなく 48 h の 30 ° C にそれらをインキュベートし、。48 時間後に変換された酵母のペレットが各ウェルの下部に表示されている注意してください。</li>
	<li>液体ディスペンサーを使用すると、96 ウェルのプレートの新しいセットの各ウェルに裏メディア含むブドウ糖の 100 μ L を追加します。</li>
	<li>渦 30 1,000 rpm で (ステップ 2.13) から変換された酵母を含むプレート s の滅菌プラスチック 96 ピン replicator を使用して、変換後の酵母を含む井戸にピンを配置し、新しいプレートの対応する井戸にそれらを接種します。メディアでいっぱい。30 ° C 24 時間で新しい版を孵化させなさい。 注: 10 皿の場合は、媒体も不要マルチ チャンネル ピペットを使用して手動で。</li>
	<li>24 時間後は、酵母のペレットは正常に変換された酵母を含む各ウェルの底に見えるはずです。グリセロールとしてこれらの酵母菌を保存する 50% のグリセロールの 50 μ L を各ウェルに追加渦 30 プレート 1,000 rpm で s シーリング テープでプレートをシール、-80 ° C でフリーズ 注: 上記の手順は、一度実行するのみ必要。同じライブラリ ディスポーザブル試薬リザーバーに対する異なる酵母モデルの今後の上映は、グリセロールから起動し、すぐに以下の手順から続行できます。</li>
</ol>3. ライブラリの遺伝子とクエリ酵母を含むセルの間で合う
<ol><li>グリセロール ストックからライブラリ系統を復活させるには、-80 ° C のフリーザー、シーリング テープと聞かせて酵母を約 30 分間室温で解凍削除の 96 ウェル プレートを取り出してください。</li>
	<li>酵母は解凍後、96 ウェル プレートで新鮮な裏メディア含む 2% ブドウ糖の 160 μ L にグリセロールを接種するとライブラリの菌株を使用した直後に 30 ° c 24 時間それらを孵化させなさい滅菌プラスチック 96 ピン レプリケーターを使用します。、シーリング テープ、シール プレート、-80 ° C のフリーザーにそれらを返します。</li>
	<li>同じ日に図書館の菌株 (W303α) を解凍、クエリの酵母を接種する (ここで W303a で FUS) 50 mL YPD に一晩 250 rpm で振とうしながら 30 ° C でそれを成長と。</li>
	<li>次の朝、滅菌ディスポーザブル試薬リザーバーとマルチ チャンネル ピペットを使用して 96 ウェル プレートの各ウェルにクエリの菌株の 160 μ L 分注するクエリ酵母のひずみを注ぐ。</li>
	<li>液体ディスペンサーを使用すると、10 の 96 ウェル プレートの各ウェルに YPD 媒体の 160 μ L を調剤します。ライブラリ酵母とクエリの酵母を交尾の後でこれらのプレートを使用します。</li>
	<li>簡単に渦クエリひずみとクエリを転送する滅菌 96 ピン レプリケーターを使用してを含む 96 ウェル プレートは、YPD プレートにひずみ。</li>
	<li>簡単に渦ライブラリはプレートのひずみし、プレート、各ライブラリの歪みモデル「新しい滅菌 96 ピン レプリケーターを使用してクエリの負担で接種されて YPD プレートにライブラリ系統を転送。 注: グリセロールのセルは、複数の凍結融解サイクル後、生存を失います。ライブラリ株を長期保存 (-80 ° C のフリーザー) できるだけ早く返す、良質のライブラリを維持し、将来の使用のための準備します。やりゃ、グリセロール ストック冷凍でき、少なくとも 10 倍を解凍します。作業コピーとグリセロール ストックのバックアップ コピーを維持するを強くお勧めします。在庫が機能しない場合すぐに新しいの作る作業バックアップ コピーからコピーです。</li>
	<li>30 ° C 24 時間、酵母のペレットが表示される注意ください各ウェルの底に 24 h 後で YPD プレートを孵化させなさい。</li>
	<li>塗りつぶし 96年ウェル プレート 2% ラフィノース、クエリ株のプラスミドに関するライブラリ プラスミド (例えば、ここ裏 - 彼-) の選択可能なマーカーに対応する最小ドロップ アウト中。</li>
	<li>滅菌 96 ピン replicator を使用して、YPD 培地、文化の交配から酵母を転送します。48 h; 30 ° C で 96 ウェルのプレートを孵化させなさいだけ酵母交尾細胞形成された二倍体細胞し、したがって、両方のクエリ プラスミドを含むし、ライブラリ プラスミドがこのメディアに成長することができます。2 日後、ウェルの底にペレットが表示されることを確認します。</li>
</ol>4. スポッティング アッセイ
<ol><li>
ラフィノースを含む選択メディアの成長の 48 時間後酵母を寒天にスポットします。
	<ol>
<li>2% 寒天明らかポリスチレン製プレート、1 つ含む 2% ガラクトースおよび他含んでいる 2% ブドウ糖を含む裏彼ドロップ アウト プレートの 2 セットを準備します。</li>
		<li>1,000 rpm で 1 分間ボルテックス 96 ウェル プレートは、酵母 2% ガラクトースと 2% 寒天培地 (FUS とライブラリの遺伝子は誘導される) を含む裏彼ドロップ アウト プレートと 2% のグルコース, 2% 寒天培地 (FUS とライブラリの遺伝子を含む裏彼ドロップ アウト プレートをスポットします。抑圧された)、各文化も発見されます 4 連で寒天プレートの上にロボットのスポッティング マシンを使用して (すなわち1 の文化も発見されます寒天プレートの 4 点へ)。</li>
		<li>スポッティング後、乾燥し、30 の ° C の定温器に逆さまに置く寒天をしましょう。クエリのひずみへの毒性が救出される/より高速な酵母の成長を記録するまたはクエリのひずみへの毒性をさらに悪化/より遅い成長を記録する寒天のすべての 24 h を撮影します。4 日間の版を孵化させなさい。 注: それぞれの文化も発見できます寒天プレート 1-1、以前の変換に基づく方法10のように。ただし、1-に-4 ここでスポッティング (これはロボットのスポッティングのマシンを使用して簡単に設定できます) 偽陽性の数を減らし、アッセイの堅牢性が増大します。肯定的なヒットは同じからすべてのコロニーがよく類似した表現型を表示するときのみ考慮されます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dujon, B. A., Louis, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+diversity+and+evolution+in+the+budding+yeasts+(Saccharomycotina).">Genome diversity and evolution in the budding yeasts (Saccharomycotina).</a> Genetics. 206 (2), 717-750 (2017).</li><li>Khurana, V., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+neurodegeneration+in+Saccharomyces+cerevisiae:+why+cook+with+baker's+yeast.">Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker's yeast.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).</li><li>Willingham, S., Outeiro, T. F., DeVit, M. J., Lindquist, S. L., Muchowski, P. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+toxicity+in+neuronal+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+by+hUPF1.">Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (25), 7821-7826 (2015).</li><li>Jackson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+forelimb+function+by+UPF1+gene+therapy+in+a+rat+model+of+TDP-43-induced+motor+paralysis.">Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced motor paralysis.</a> Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).</li></ol>

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ここでは、酵母モデルにプラスミド ライブラリを導入する交尾を用いた酵母プラスミド発現画面を実行するプロトコルについて述べる。このアプローチを使用すると、複数の酵母モデル神経変性疾患タンパク質毒性の酵母プラスミド ライブラリと変形の同じコレクションを使用して上映されます。変換の骨の折れるプロセスのみを非常に効率的な酵母後交尾がクエリひずみにプラスミド ラ?...

出芽酵母酵母は、直接人間の病気に関連して細胞のプロセスを理解する基本的な科学研究1で広く使用されています。さらに、それ使用されていますモデル生物として、最も一般的な神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側を含むにリンクなど、ヒトの疾患関連タンパク質を勉強横方向性硬化症 (ALS) の2。酵母モデルの利点は、ゲノム広い画面がこのように毒性のメカニズムへの洞察力を与えて、疾患関連蛋白質の毒性に関連する細胞の経路を識別するために行うことができます簡単です。このような 1 つの画面は、どの遺伝子が過剰に発現すると、毒性を変更できますを識別するために酵母のモデルに変換はそれぞれ配列ライブラリで 5,500 酵母遺伝子の過剰発現のライブラリ画面と呼ばれます。このスクリーニング法は、複数神経変性疾患関連蛋白質のハンチントン病3パーキンソン病4,5 α-シヌクレインの huntingtin を含む酵母モデルで正常に適用されています。、アルツハイマー病6FUS と ALS7,8,9の TDP 43 a β。通常、高スループット方法10で行われますが、画面の最も労働集約的なステップの 5,500 の酵母の遺伝子配列ライブラリから個別に変換です。上映が繰り返されるたびにこの手順を実行する必要がありするたびに新しく設立された酵母モデルは調査される必要性します。このタスクを実行するより効率的な方法を見つけることが重要です。
酵母は半数体と 2 倍体の両方の形態で安定に存在できます。交配交配型単相の細胞のタイプの反対の 2 つがある、および α。 各交配の細胞の倍加の食材を入力して反対側に嵌合型細胞のみが対応、独自の特定交尾フェロモンを分泌します。これはの間で合うことができますと α/α は、安定した二倍体細胞を生成する細胞。このプロセスは、自然と非常に効率的な11です。出芽酵母プラスミド ライブラリを紹介するこのユニークなライフ サイクルを利用することができます。具体的には、各遺伝子プラスミド配列ライブラリでは 1 つの交配型、すなわち、α 細胞の半数体の細胞に変換されます。ライブラリの遺伝子を含むこれらの細胞は、アレイの 96 ウェル フォーマットのグリセロール ストック保存されます。グリセロール ストックから、選別する必要がある各酵母モデルのライブラリ遺伝子を含む酵母細胞を解凍できるし、逆交配型,すなわち, 交配型の興味の酵母モデルとの交配によって、スクリーニングを行うことができます。酵母に一緒に 2 つの遺伝子を持って交配を使用してのこの考えは新しくないです。高スループット酵母ツーハイブリッド法、餌が 1 つの交配型 (すなわち、Gal4 DNA 結合ドメイン融合) 構築を一緒に配列ライブラリから獲物コンストラクトの交配によってもたらされる正常に適用されています。12します。 ただし、この戦略は決して過剰発現ライブラリ上映は、伝統的な変換方法は常に使用に適用されています。
私たちの研究室は以前 ALS 関連タンパク質 FUS7の酵母モデルを確立しました。変換法を用いた発現ライブラリ スクリーニングを通じて高い FUS の毒性を救う 5 つの酵母遺伝子 (ECM32、NAM8、SBP1、SKO1、およびVHR1) を発見しました。これらの所見が独立してによって確認された同様の調査で別のグループ8。hUPF1、 ECM32の人間の相同物は初代神経細胞13と ALS14と同様の動物モデルでの毒性を抑制して後で示されました。これらの 5 つの遺伝子を使用すると、原則の証拠として、交配による FUS 酵母モデルに導入している場合すべての 5 つの遺伝子が同様に FUS 毒性を救出を紹介します。ライブラリの遺伝子を含む酵母細胞はグリセロール ストックで永続的に保存でき、必要な時に復活、以来この交配に基づくメソッドの変換ライブラリに対して上映するたびに時間がかかるステップが削除されます。交尾は関与プラスミド変換効率が高いため、この戦略は精製と大型プラスミド ライブラリの変換に関連付けられているコストも大幅減少します。FUS の酵母モデルに対するスクリーニング ライブラリにこのメソッドが正常に適用されます。
交尾ベースのスクリーニングの手順は、図 1で簡単に説明します。当初は、アレイ プラスミド ライブラリは、96 ウェル プレートの各ウェルに特定のライブラリ プラスミドで形質転換酵母が含まれている高スループット イースト変形のプロトコルを使用して型 α を交配の半数体酵母に変換されます。変換された酵母のこのコレクションは、解凍して使用後に復活できるグリセロール ストックとして保存されます。反対の交配型と半数体酵母の関心は、このケースの FUS 毒性の酵母モデルを生成する必要が (交配型、)。滅菌の 96 ピン レプリケーターを使用して高スループット方法で FUS ひずみと酵母プラスミド ライブラリを含むがリッチ ・ メディアを含む 96 ウェル プレートに転送され、仲間にできます。次の交尾、それぞれから少量交尾文化の井戸が両方の FUS を含むどのだけ二倍体酵母の合成ドロップ アウト メディアを含む 96 ウェル プレートに転送され、ライブラリ遺伝子が成長することができます。ロボット スポッティング マシン、FUS およびライブラリ遺伝子の発現が誘導される寒天プレート上に各ウェルから酵母培養を転送する使用されます。 さらに、酵母培養は、FUS とライブラリ遺伝子が表現されてない寒天を制御する発見されます。次の寒天版で成長、救助または FUS 毒性を悪化させる遺伝子が識別されます。

<table><tbody><tr><td>salmon Sperm DNA (SS-DNA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp; D1626</td><td></td></tr><tr><td>YPD broth</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>Y20090</td><td></td></tr><tr><td>Granulated Agar</td><td>Fisher Sci</td><td>BP97445</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>G32040</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Galactose</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>G33000</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Raffinose Pentahydrate</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>R20500</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Sulfate</td><td>Fisher Sci</td><td>A702-500</td><td></td></tr><tr><td>Synthetic Ura- drop out medium</td><td>Clontech</td><td>630416</td><td></td></tr><tr><td>Yeast amino acid drop out supplement -Histidine/-Uracil</td><td>Clontech</td><td>630422</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and Ammonium Sulfate</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>Y20060</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Fisher Sci</td><td>S67496</td><td></td></tr><tr><td>Lithium acetate, anhydrous</td><td>Fisher Sci</td><td>AC268640010</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene Glycol 3350 (PEG-3350)</td><td>Spectrum Chemical&amp;nbsp;</td><td>PO125-12KG</td><td></td></tr><tr><td>96 Pin Replicator&amp;nbsp;</td><td>Scinomix</td><td>SCI-5010-OS</td><td></td></tr><tr><td>Nunc OmniTray</td><td>Thermo Sci</td><td>140156</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 96 well assay plate, round bottom with lid</td><td>Fisher Sci</td><td>07-200-760</td><td>non-treated, sterile</td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;nbsp;Research plus Multichannel Pipette</td><td>Eppendorf</td><td>TI13690052</td><td>30-300ul volume</td></tr><tr><td>Fisherbrand&amp;nbsp;Isotemp Digital Dry Baths/Block Heaters</td><td>Fisher Sci</td><td>88-860-023</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;nbsp;MixMate</td><td>Eppendorf</td><td>21-379-00</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5810R Centrifuge</td><td>Fisher Sci</td><td>05-413-112</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-26 XPI Centrifuge</td><td>Beckman</td><td>393127</td><td></td></tr><tr><td>MultiFlo FX Multi-Mode Dispenser</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor HDA&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mating-based overexpression library screening in yeast

出芽酵母は、人間の病気と関連付けられる蛋白質の勉強にモデルとして広く使用されています。ゲノム遺伝学的スクリーニングは、酵母の研究でよく使用される強力なツールです。酵母における神経変性疾患関連タンパク質の発現を引き起こす細胞毒性と会合体形成、これらの障害を持つ患者で見られる所見をさたします。ここでは、その毒性の修飾子の筋萎縮性側索硬化症関連タンパク質 FUS の酵母モデルをスクリーニングするための手法について述べる。変換を使用する代わりにこの新しいスクリーニング プラットフォームは酵母酵母モデルへのプラスミド配列ライブラリの導入の合うことに依存しています。交尾のメソッドは 2 つの明確な利点: 最初に、それは非常に効率的な;第二に、プラスミドの変換前の配列ライブラリ格納できるグリセロール ストックとして長期の酵母モデルに変換の手間のかかるステップなし他の画面にすぐに適用されるたびに。このメソッドを正常に使用する方法を示す変更 FUS の毒性遺伝子のスクリーニングに。

ALS 関連タンパク質、RNA ・ DNA 結合タンパク質 FUS は半数体酵母7,8で以前調べた。遺伝のスクリーニングの使用して変換に基づく方法は、FUS 毒性を抑制するいくつかの酵母の遺伝子を発見しました。原発神経細胞と ALS13のモデルラットにおける毒性を抑制することで効果を発揮する酵母遺伝子の 1 つの人間?...

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Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

アレイ プラスミド ライブラリを使用して出芽酵母の発現スクリーニングを容易に交配に基づく手法を提案します。

酵母の過剰発現の交尾ベース ライブラリ スクリーニング

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

7.6K ビュー.  Wright State University. アレイ プラスミド ライブラリを使用して出芽酵母の発現スクリーニングを容易に交配に基づく手法を提案します。

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A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the discovery of high-affinity interactors that are highly enriched in the library of interacting candidates. In a traditional format, the yeast 2-hybrid assay can yield too many colonies to analyze when conducted at low stringency where low affinity interactors might be found. Moreover, without a comprehensive and complete interrogation of the same library against different bait plasmids, a comparative analysis cannot be achieved. Although some of these problems can be addressed using arrayed prey libraries, the cost and infrastructure required to operate such screens can be prohibitive. As an alternative, we have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing a strategy termed DEEPN (Dynamic Enrichment for Evaluation of Protein Networks), which incorporates high-throughput DNA sequencing and computation to follow the evolution of a population of plasmids that encode interacting partners. Here, we describe customized reagents and protocols that allow a DEEPN screen to be executed easily and cost-effectively.

Batch processing of yeast 2-hybrid screens allows for direct comparison of the interaction profiles of multiple bait proteins with a highly complex set of prey fusion proteins. Here, we describe refined methods, new reagents, and how to implement their use for such screens.

蛋白質の相互作用を比較するバッチの酵母 2 ハイブリッド スクリーン

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

生化学

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely related biochemical pathways. Previous methods such as the Synthetic Genetic Array (SGA) analysis, and random mutagenesis techniques using ultraviolet (UV) or chemicals like ethyl methanesulfonate (EMS) or N-ethyl-N- nitrosourea (ENU), have been widely used but are often costly and laborious. Also, these mutagen-based screening methods are frequently associated with severe side effects on the organism, inducing multiple mutations that add to the complexity of isolating the suppressors. Here, we present a simple and effective protocol to identify suppressor mutations in mutants which confer a growth defect in Schizosaccharomyces pombe. The fitness of cells with a growth deficiency in standard rich liquid media or synthetic liquid media can be monitored for recovery using an automated 96-well plate reader over an extended period. Once a cell acquires a suppressor mutation in the culture, its descendants outcompete those of the parental cells. The recovered cells that have a competitive growth advantage over the parental cells can then be isolated and backcrossed with the parental cells. The suppressor mutations are then identified using whole-genome sequencing. Using this approach, we have successfully isolated multiple suppressors that alleviate the severe growth defects caused by loss of Elf1, an AAA+ family ATPase that is important in nuclear mRNA transport and maintenance of genomic stability. There are currently over 400 genes in S. pombe with mutants conferring a growth defect. As many of these genes are uncharacterized, we propose that our method will hasten the identification of novel functional interactions with this user-friendly, high-throughput approach.

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

We present a simple suppressor screen protocol in fission yeast. This method is efficient, mutagen-free, and&#160; selective&#160; for&#160; mutations that&#160; often&#160; occur at&#160; &#160;a&#160; single&#160; genomic&#160; locus.&#160; The protocol is suitable for isolating suppressors that alleviate growth defects in liquid culture that are caused by a mutation or a drug.

分裂酵母分裂酵母のディープ シーケンス アシスト、自発的な抑制画面

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

遺伝学

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and computational approaches. One such method is the yeast one-hybrid (Y1H) assay, in which interactions between TFs and DNA regions are tested in the milieu of the yeast nucleus using reporter genes. Y1H assays involve two components: a &#8216;DNA-bait&#8217; (e.g., promoters, enhancers, silencers, etc.) and a &#8216;TF-prey,&#8217; which can be screened for reporter gene activation. Most published protocols for performing Y1H screens are based on transforming TF-prey libraries or arrays into DNA-bait yeast strains. Here, we describe a pipeline, called enhanced Y1H (eY1H) assays, where TF-DNA interactions are interrogated by mating DNA-bait strains with an arrayed collection of TF-prey strains using a high density array (HDA) robotic platform that allows screening in a 1,536 colony format. This allows for a dramatic increase in throughput (60 DNA-bait sequences against &#62;1,000 TFs takes two weeks per researcher) and reproducibility. We illustrate the different types of expected results by testing human promoter sequences against an array of 1,086 human TFs, as well as examples of issues that can arise during screens and how to troubleshoot them.

Here, we present an enhanced yeast one-hybrid screening protocol to identify the transcription factors (TFs) that can bind to a human DNA region of interest. This method uses a high-throughput screening pipeline that can interrogate the binding of &#62;1,000 TFs in a single experiment.

人間の DNA 配列に結合する転写因子を識別するために強化されたイースト 1 ハイブリッド スクリーン

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

ホスト病原体のタンパク質 - タンパク質相互作用の風景を特徴づけるために比較的アプローチ

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

免疫・感染学

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

ハイスループット酵母プラスミドの過剰発現の画面

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

生物学

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

バーコード酵母ライブラリーの競争力のあるゲノム画面

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

<meta charset="utf8"></head><body>酵母表面ディスプレイ技術によるタンパク質機能の最適化

Protein Engineering by Yeast Surface Display

Protein engineering enables the improvement of existing functions of a given protein or the generation of novel functions. One of the most widely used and versatile tools in the protein engineering field is yeast surface display, where a pool of randomized proteins is expressed on the surface of yeast. The linkage of phenotype (e.g., binding of the yeast-displayed protein to the antigen of interest) and genotype (the plasmid encoding for the protein variant) enables selection of this library for desired properties and subsequent sequencing of enriched variants. By combining magnetic bead selection with flow cytometric sorting, protein variants with enhanced binding to a target antigen can be selected and enriched. Notably, in addition to affinity maturation, binding to a target can also be achieved without any initial binding affinity. Here, we provide a step-by-step protocol that covers all essential parts of a yeast surface display selection campaign and gives examples of typical yeast surface display results. We demonstrate that yeast surface display is a broadly applicable and robust method that can be established in any molecular biology laboratory with access to flow cytometry.

<meta charset="utf8"></head><body>酵母表面ディスプレイによるタンパク質工学

This protocol describes the essential steps for conducting yeast surface display selection campaigns to enrich protein variants binding to an antigen of interest.

酵母表面ディスプレイによるタンパク質工学

Protein engineering enables the improvement of existing functions of a given protein or the generation of novel functions. One of the most widely used and ...

生物工学

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

指向進化方法で<em&gt;サッカロマイセス・セレビシエ</em&gt;：変異体ライブラリーの作成およびスクリーニング

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

酵母の過剰発現の交尾ベースライブラリスクリーニング

要約

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蛋白質の相互作用を比較するバッチの酵母 2 ハイブリッドスクリーン

分裂酵母分裂酵母のディープシーケンスアシスト、自発的な抑制画面

人間の DNA 配列に結合する転写因子を識別するために強化されたイースト 1 ハイブリッドスクリーン

ホスト病原体のタンパク質 - タンパク質相互作用の風景を特徴づけるために比較的アプローチ

ハイスループット酵母プラスミドの過剰発現の画面

バーコード酵母ライブラリーの競争力のあるゲノム画面

酵母表面ディスプレイによるタンパク質工学

酵母表面ディスプレイによるタンパク質工学

酵母表面ディスプレイによるタンパク質工学

指向進化方法で

酵母の過剰発現の交尾ベース ライブラリ スクリーニング

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分裂酵母分裂酵母のディープ シーケンス アシスト、自発的な抑制画面

人間の DNA 配列に結合する転写因子を識別するために強化されたイースト 1 ハイブリッド スクリーン

ホスト病原体のタンパク質 - タンパク質相互作用の風景を特徴づけるために比較的アプローチ

ハイスループット酵母プラスミドの過剰発現の画面

バーコード酵母ライブラリーの競争力のあるゲノム画面

酵母表面ディスプレイによるタンパク質工学

酵母表面ディスプレイによるタンパク質工学

酵母表面ディスプレイによるタンパク質工学

指向進化方法で

酵母の過剰発現の交尾ベースライブラリスクリーニング

蛋白質の相互作用を比較するバッチの酵母 2 ハイブリッドスクリーン

分裂酵母分裂酵母のディープシーケンスアシスト、自発的な抑制画面

人間の DNA 配列に結合する転写因子を識別するために強化されたイースト 1 ハイブリッドスクリーン