インビボおよびインビトロ実験用グシュカン(GSK)顆粒の調製

このプロトコルは、インビボ研究のための顆粒の働く溶液の調製、ならびにインビトロ実験用の顆粒含有血清の調製を施設化する。この手法の利点の 1 つは、実験のために作成する材料や動物のコストが低いため、この方法を簡単に繰り返すことができる点です。まず、個々の50ミリリットルチューブに8グラム、16グラム、24グラムのグシュカン(GSK)顆粒を加えます。

各チューブに48ミリリットルの水を加え、チューブを振って顆粒を完全に溶解します。次に、ビタミンD3を添加した炭酸カルシウム1.6錠を別の50ミリリットルチューブに入れ、48ミリリットルの生理食塩水に錠剤を振るで溶解する。溶液の胃内投与のために、最初に穏やかに、しかししっかりと手動で1ヶ月の女性、C57ブラック6マウスを2〜3分間拘束する。

マウスが落ち着いたら、GSK顆粒の1つの作業溶液の0.24ミリリットルで40ミリメートル、番号12のガバジ針をロードし、針の抵抗が感じられるまで口の片側を通してマウスにガビンジ針を置き、針が胃に達したことを示します。動物に働く解決の全体の容積を注入する。次に、ガバジ針を引き込み、他のマウスがGSKを投与されている間にマウスをケージに戻してから、同じように各マウスに0.24ミリリットルの炭酸カルシウムとビタミンD3溶液を注入する。

GSK含有血清採取については、ちょうど実証したように、適切な濃度のGSKをガビンジによってラットに送達した後、最後のGSK顆粒投与の1時間後につまみつまみへの応答の欠如を確認する。腹部の皮膚と腹膜切開を行い、腹部を胸郭の底に露出させます。ティッシュペーパーを使用して腹部大動脈の結合組織を取り除き、血管をはっきりと露出させ、大動脈から血液を引き出すために22ゲージの針を装備した10ミリリットルの注射器を使用する。

血液を無菌15ミリリットルチューブに移し、チューブを室温で30〜60分間直立させます。血液が凝固したら、チューブを遠心分離して血清を分離し、最大6匹のラットの血清をすべて新しい50ミリリットルチューブに移します。56°Cの水浴で血清成分を30分間不活性化する前に、セラを混ぜるためにチューブを振ります。

その後、0.22マイクロメートルサイズの親水性ポリエーテルスルホンシリンジフィルターを通して、血清をマイナス80°Cで最長1年間濾過します。インビトロ骨切皮新生の場合、L-グルタミン、リボヌクレオシド、およびデオキシリボヌクレオシドを添加した最小イーグル培地を1対4の比率でGSK含有血清の3用量を希釈する。96ウェルプレートの骨髄マクロファージ培養液の各ウェルに各希釈液の200マイクロリットルを加えます。

次に、マクロファージコロニー刺激因子と核因子-κBリガンドの受容体活性化剤を用いて各々を刺激することにより、破骨細胞生成を開始する。インビトロ骨芽細胞化の場合、24ウェルプレートの骨間葉系幹細胞培養液の各ウェルに希釈GSK含有血清を2ミリリットル加える。マイクロコンピュータ断層撮影の結果は、卵巣切除マウスが生理的制御マウスと比較して有意な骨損失を示すことを示している。

GSK顆粒処理の90日間の介入は、骨髄密度を大幅に増加させます, 特に中用量GSK処理動物で.GSK顆粒処理はまた、骨膜骨数の増加、総体積に対する骨容積、および骨骨の厚さをもたらすが、骨-骨骨分離の減少をもたらす。酒石耐性酸ホスファターゼ(TRAP)染色は、コントロール動物と比較して卵巣切除マウスの破骨細胞数の増加を明らかにし、GSK顆粒治療は卵巣切除動物と比較してTRAP陽性破骨細胞分化を減少させる。

GSK顆粒含有血清はまた、対照動物から採取された血清と比較してTRAP陽性破骨細胞の数を減少させる。腹部大動脈への針の正常な浸透は、各ラットから十分な量の血液が収穫されることを保証するために重要です。この方法の実行に成功すると、15〜20ミリメートルの血液の蓄積を割り当て、インビトロ実験に使用するのに十分な材料を与える必要があります。