私たちは、分子脳神経外科組織銀行のための貴重な研究資料を提供したヴァンダービルト大学医療センターの患者に特にお世話になっています。ティッシュバンク、リード・C・トンプソンMD(主任研究者)、チェリー・キナードRN(リサーチナース)、ラリー・A・ピアースMS(マネージャー)を設立し、維持してくれた方に感謝します。組織学的サービスは、ヴァンダービルト大学医療センター(VUMC)トランスレーショナル病理学共有リソース(ヴァンダービルト・イングラムがんセンターに授与5P30 CA068485によってサポートされている)によって部分的に行われました。この作業は、NINDS(1R21NS070139)、バロウズ・ウェルカム・ファンド、VMC開発資金からのMKCへの助成金によって支えられました。MKCは、退役軍人省、退役軍人保健局、研究開発局、生物医学研究所研究開発局の助成金1 I01 BX000744-01によってサポートされています。内容は退役軍人省や米国政府の見解を表すものではありません。

1. 腫瘍細胞懸濁液の調製
注: 原発性異種異種移植片を確立し維持するためには、患者材料および動物の使用に関する適切な制度的承認が必要である。ヴァンダービルト大学医療センターでは、診断目的で必要なものを超える切除腫瘍材料を、研究組織リポジトリの患者の同意を得て収集します。検体は無作為化された5桁のREDcapデータベース番号でラベル付けされ、すべての患者固有の識別子が除去される。REDcapデータベースには、性別、年齢(年)、人種、生存状態、病理、癌治療、切除年、および進行までの時間を含む組織リポジトリ内の各標本の同定解除された臨床データが含まれています。滅菌を維持し、原発異種移植法の成功を最適化するために、試薬、蒸気オートクレーブ手術器具、および外科部位は事前に組み立てるか、または準備する必要があります。
注: グリオーマ標本には、多くの場合、大量のミエリンおよび破片が含まれています。試料のサイズによっては、ミエリンやデブリを適切に除去するために4つ以上の不連続勾配チューブを使用する必要があります。
注: このプロセスは、明確に見える解剖されていない組織が残っていない場合、またはほとんど残っていない場合に完了する。トリアージプロセス中に気泡の導入を避けてください。
注: 解離後の細胞生存率は、典型的には>90%である。低い生存率は、手術室からの最適でない組織処理または輸送時間、凍結保存法、またはパパイン解離技術を含む多くの変数を反映し得る。しかし、十分な数の生存可能な生存率が適切な体積で移植される限り、より低い細胞の生存率は依然として十分である。各マウスに対して、50,000-200,000個の生存細胞が2μlの容積に埋め込まれます。シリンジ針のベベル先端により、最終的な体積に5μlの細胞懸濁液を追加して、各注射用の注射器に適切な材料を引き込むことができるようにする必要があります。例えば、5匹のマウスに2μl/マウスを注入するには、最終体積は15μl(15μl=(5 x 2 μl)+5μlでなければなりません。
<ol><li>実験室への輸送のために氷の上に滅菌されたキャップ付き容器に、切除され、識別され直された患者材料を置きます。移植のために直接検体を処理するか、液体窒素(下記参照)で標本を凍結保存し、液体窒素に保管し、後で使用します。</li>
	<li>キットコンポーネントとメーカーから提供される指示と滅菌フードにパパイン解離液(パパイン溶液、洗浄/プロテアーゼ阻害剤溶液および不連続勾配溶液)を準備します。ラベル無菌15 mlポリスチレン対等管と次のようにソリューションを配布します。<ul>
<li>チューブ1:パパイン溶液5ml</li>
			<li>チューブ2:3 mlの洗浄/プロテアーゼ阻害剤溶液</li>
			<li>チューブ 3-6: 5 ml 不連続勾配溶液</li>
		</ul>
</li>
	<li>5 mlのパパイン溶液でグリオーマ標本をチューブ1に入れ、10〜20分の期間にわたって5mlピペットでトリチュレートします。</li>
	<li>材料を10回上下にピペットし、次のトリアーレーションサイクルを開始する前に室温で2〜3分間インキュベートします。</li>
	<li>5 ml ピペットの先端を円錐形チューブの底に近づけ、トリチャレーションの各サイクルで、先端が最後の 2 サイクルチューブの底面に触れるようにします。</li>
	<li>室温で5分間300×gで遠心分離機。上清を取り除き、3mlの洗浄/プロテアーゼ阻害剤溶液中の10倍のペレットを上下にピペットします。</li>
	<li>慎重に「重力」分配速度に設定されたピペットで、5 mlの不連続勾配溶液(チューブ3〜6)の各上に懸濁液の等量を重ね合わせた。</li>
	<li>スイングバケットローターを装備した遠心分離機にチューブを入れ、加速速度を最低の設定に下げ、ブレーキをオフにします。室温で12分間76×gで遠心分離機。ブレーキをオフにすると、一般的に20分後に遠心分離が完了します。</li>
	<li>上清を取り除き、再懸濁し、各ペレットを5mlの無菌バランス塩溶液に組み合わせ、細胞を氷の上に置きます。</li>
	<li>細胞懸濁液の部分(10〜100 μl)を取り除き、ヘモサイトメーターによるトリパンブルー排除により生存細胞の密度を決定します。</li>
	<li>遠心分離機 300 x g で 5 分間上清を取り除き、μl当たり25,000-125,000個の生存細胞の密度で細胞ペレットを再懸濁します。</li>
	<li>細胞懸濁液の十分な容積を200 μlマイクロ遠心分離管(PCRチューブ)に移し、氷の上に置きます。</li>
</ol>2. 手術部位と器具の準備
注: 滅菌外科用手袋は処置の間に着用される。各機関の要件に応じて、外科用ガウン、キャップ、フェイスガードが必要な場合があります。
<ol><li>動物の準備、操作フィールドおよび動物の回復のための分離された隣接領域とげっ歯類の外科のための、分解されたベンチトップを準備する。</li>
	<li>蒸気オートクレーブで手術器具を殺菌する。続いて、ホットビーズ滅菌器を使用して、ある動物の対象から次の動物に移行する際に器具をフラッシュ滅菌します。</li>
</ol>3. 誘導、麻酔、麻酔
注: マウスが麻酔された時点から15分を超える手術は、接触熱源を必要とする。低体温症を予防するために、マウスは術前および術後の期間中に熱源(循環湯毛布)を提供される。 
<ol><li>各マウスが体重1グラム当たり10 μlのカクテルを注入してケタミン100mg/kgおよびキシラジン10mg/kgを受け取るような誘導麻酔用ケタミン/キシラジンカクテルを調製します。</li>
	<li>
表 1.麻酔カクテル。
		<table><tbody>
<tr>
<td rowspan="2"></td>
					<td rowspan="2">在庫集中</td>
					<td colspan="3">準備するボリューム </td>
				</tr>
<tr>
<td>1つのマウス</td>
					<td>5匹のマウス</td>
					<td>10匹のネズミ</td>
				</tr>
<tr>
<td>ケタミン</td>
					<td>100 mg/ml</td>
					<td>25 μl</td>
					<td>125 μl</td>
					<td>250 μl</td>
				</tr>
<tr>
<td>キシラジン</td>
					<td>100 mg/ml</td>
					<td>2.5 μl</td>
					<td>12.5 μl</td>
					<td>25 μl</td>
				</tr>
<tr>
<td>等張生理生理</td>
					<td></td>
					<td>223 μl</td>
					<td>1,113 μl</td>
					<td>2,225 μl</td>
				</tr>
<tr>
<td colspan="2">トータル</td>
					<td>250 ul</td>
					<td>1,250 μl</td>
					<td>2,500 μl</td>
				</tr>
</tbody></table>
</li>
	<li>ストック溶液(10 mg/ml)1:20を無菌で1:20に希釈して鎮痛用ケトプロフェン溶液を調製し、各マウスが体重1グラム当たり10μlの溶液を注入して5mg/kgの用量を受け取るようにします。</li>
	<li>計量し、術前の体重を記録します。個々のマウスウェイトは異なりますが、一般的には18〜22gの範囲です。</li>
	<li>マウス体重1グラム当たりケタミン/キシラジンカクテルをインスリン注射器で腹腔内空間に10μl注入します。例えば、20gマウスに200μlを注入します。</li>
	<li>後ろ足のつまみでマウスが完全に麻酔を受けるかどうかを確認します。マウスがピンチから撤退しなくなるのに、一般的に3〜5分かかります。</li>
	<li>マウス体重1グラム当たりのケトプロフェン溶液をインスリン注射器で脇腹の緩い皮膚に皮下に10μl注入する。例えば、20gマウスに200μlを注入します。</li>
	<li>頭蓋骨の上に髪をバリカンで剃り、綿の先端アプリケーターを使って露出した頭皮をポビドネヨウ素でこすり、アルコールパッドを拭きます。これらのステップを繰り返し、ポビドネヨウ素スクラブとアルコール拭き、さらに2回。</li>
	<li>マウスの目に眼科軟膏を塗布する。</li>
	<li>無菌メスの刃で目の前に耳の後ろから伸びる1cmの正中線切開を作ります。</li>
	<li>マウスを解剖スコープの下に置き、頭蓋骨を露出させて縫合線を特定します。ドリルで円形の動きを使用して、2.5mmの横方向のバリ穴をブレグマに、1 mm後部をコロナ縫合糸に中央に配置します。</li>
</ol>4. 頭蓋内移植
注: 2.5 μlを超える注入量は、マウスに対して致死的である可能性があります。
<ol><li>上部の切り込み部を切り身バーの上に引っ掛け、鼻クランプを適用して、頭蓋骨が中立的な位置にしっかりと保持されるようにして、ステレオチックフレームにマウスを置きます。</li>
	<li>マイクロ遠心分離管内の細胞の5〜10 μlを数回上下に引き込み、立体式マニピュレータのプローブホルダーにクランプした10μlのハミルトンシリンジに取り込み、懸濁液を混合して気泡を除去します。プランジャーを押し下げるので、シリンジに2μl(1匹の動物を注入するのに十分な量)がロードされます。</li>
	<li>皮膚切開部の横縁を引っ張ってバリ穴を露出させ、マイクロマニピュレーターで針をバリ穴に入れ、ベバ部分が頭蓋骨表面のすぐ下になるようにします。<ol>
<li>針を3mm進めてから針を0.5mm引き出して、注射用のスペースを作ります。</li>
			<li>プランジャーを30秒以上ゆっくりと進め、針を脳内に残してさらに2分間進めます。0.5 mm上昇して徐々に針を引き出し、さらに30秒待ってから、脳から針を取り除きます。</li>
		</ol>
</li>
	<li>定位フレームからマウスを取り外し、オートクリップで巻を閉じます。</li>
	<li>体温を維持し、粘膜と露出した組織(足の裏)の呼吸パターンと色を継続的に監視するために、加温パッドの上にマウスを置きます。</li>
	<li>麻酔(胸部および外来)から完全に回復したら、無菌ミクロアイソレーターケージにマウスを入れ、動物の住宅施設に戻します。</li>
</ol>5. 移植後の動物のケアと観察
注: 腫瘍の生着および浸潤成長の最も信頼できる徴候は、ハンチ姿勢および粗い毛髪の上皮の発達を伴う漸進的で持続的な体重減少である。まれに、神経学的欠乏は運動失調、麻視、発作を含む指摘される。異形性原発異種移植片は非常に侵襲性が高く、長期間にわたって発達する。マウスは通常、移植後3〜6ヶ月の腫瘍増殖の症状を現す。
<ol><li>切開部位での食物および水の摂取、行動、グルーミング、および感染の兆候について、異交性異種移植片を持つマウスを毎日観察する。</li>
	<li>痛みや苦痛が術後に観察された場合、ケトプロフェン(皮下5mg/kg、1日1〜2倍)を投与する。</li>
	<li>手術後8~10日後にオートクリップを取り外します。</li>
	<li>マウスの体重は毎週です。</li>
	<li>腫瘍の生着の徴候および症状を監視する。</li>
</ol>6. 腫瘍ハーベスティング
注: この方法により、第1のコロナスライス(#1)は、嗅球の後部の側面と前葉の前部の側面を含む。生着した腫瘍は、その後の3つのコロナスライス(スライス#2、#3、#4)の右半球に最も豊富であり、注射部位はコロナスライス#3に日常的に含まれています。実験の必要性に応じて、材料は、腫瘍の通過、凍結組織切片、ホルマリン固定パラフィン埋め込み組織切片、解離組織のフローサイトメトリー、DNA、RNA、またはタンパク質分析のための細胞培養またはリセートに使用され得る。腫瘍の一部は、80〜95%の範囲の細胞生存率を有する将来のニーズのために凍結保存され得る。
<ol><li>二酸化炭素への長期暴露によってマウスを安楽死させ、続いて子宮頸部脱臼を行う。</li>
	<li>脳の基部(頭蓋マグナムレベル)で大きな手術用ハサミで安楽死させたマウスを切断し、切開から皮膚を前方に引っ張って頭蓋骨を完全に露出させる。</li>
	<li>脳を取り除く。<ol>
<li>頭蓋骨の左側に沿って後頭部骨を切断するために、左外部聴覚肉のレベルに孔マグナムの側面に細かい外科用ハサミの1つの先端を挿入します。右側に同じカットを実行します。</li>
			<li>一方の外部聴覚肉からもう一方の外熱部に沿って後頭部骨を切断し、小脳を露出させるために骨を取り除く。</li>
			<li>目の間の鼻骨板を切ります。</li>
			<li>鼻骨板から尾大に矢状縫合糸に沿って後に切断することによって、矢状縫合を切断します。ラムダからブレグマに前から切断することによって、矢状縫合に沿って正中切開を完了します。</li>
			<li>慎重に頭蓋の開口部に沿って鉗子の細かいペアの先端を挿入して、頭蓋骨の硬膜接着を脳に引き裂き、2つの頭蓋骨を横に皮をむいて脳と嗅球を逆に露出させる。</li>
			<li>嗅球の腹側の側面と頭蓋骨の間の鉗子を滑って、あらゆる癒着を解放する。</li>
			<li>頭蓋骨を後ろに傾けて、視神経やその他の脳神経が露出するように脳を後退させます。脳神経を切断し、脳を無菌PBSを含む皿に放出する。</li>
		</ol>
</li>
	<li>重さのあるヘラで脳をマトリックススライサーに移し、カミソリの刃で2mmコロナスライスを生成します。</li>
	<li>さらに目視検査と組織処理のために滅菌PBSを含む皿にコロナスライスを配置します。</li>
</ol>7. 腫瘍凍結保存
<ol><li>凍結保存培地のストック溶液を準備する。<ol>
<li>増殖サプリメント50ml、ペニシリン100x溶液5ml、レンサマイシン溶液5ml、0.2%ヘパリン450μlを450mlの基底培地に加えます。</li>
			<li>光から保護された4°Cで在庫液を保管してください。</li>
		</ol>
</li>
	<li>凍結保存媒体の作業溶液を準備します。<ol>
<li>50mlポリプロピレンコニカルチューブに47.5mlの凍結保存培地と2.5mlの無菌DMSOを組み合わせてよく混ぜます。</li>
			<li>アリコート1.0 mlの作業溶液を各クライボシャルにし、光から保護された4°Cで保存します。</li>
		</ol>
</li>
	<li>ゼノグラフトされた脳の2mmコロナスライスを氷の上に凍結保存培地を含む凍結に入れる。</li>
	<li>バイアルをしっかりとキャップし、-80°Cの冷凍容器に入れます。 翌日、凍結液を液体窒素タンクに移し、より長く貯蔵します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Johnson, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+between+drug+activity+in+NCI+preclinical+in+vitro+and+in+vivo+models+and+early+clinical+trials.">Relationships between drug activity in NCI preclinical in vitro and in vivo models and early clinical trials.</a> Br. 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著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。

培養細胞株、異種移植片および遺伝子組み換えマウスは、神経膠腫をモデル化するための最も一般的な方法であり、各モデルシステム3,13,14には明確な利点と限界がある。原発性異形性神経膠腫の関連する利点には、びまん性神経膠腫を代表する浸潤性増殖と、培養グリオーマ細胞で維持することが非常に困難な遺伝的変化および重要なシグナル伝達メカニズムの保持が含まれる。例?...

悪性神経膠腫は、脳および時には脊髄で起こる中枢神経系の原発性グリア腫瘍である。神経膠腫は、組織学的に天文学的に類似しており、組織学的に占星細胞、オリゴデンドロサイトまたはエセンディマル細胞に従って分類され、悪性腫瘍の病的特徴について数値的に等級(I〜IV)に分類される。最も一般的な組織学的サブタイプは、アストロサイトーマ、オリゴデンドロリオ腫および混合オリゴアストロサイトーマである。WHOグレードII〜IVを包含する悪性神経膠腫は、侵襲的な成長および現在の治療法への再特性によって特徴付けられる。米国では毎年、約15,750人が悪性神経膠腫と診断され、推定12,740人の患者がこの病気に屈しています。これらの統計は、悪性神経膠腫の特に致死的な性質と強化された治療効果の重要な必要性を強調する。
がんモデルは、腫瘍生物学や治療法の調査に不可欠です。ヒト癌細胞株は、インビトロ操作および生体内異種移植研究(二次異種移植片)1に対する重要な第一歩を表す。しかしながら、標準的な癌細胞培養は、二次異種移植片5では回復し得ない形質および遺伝子型変換2~4を受ける。さらに、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(IDH)変異6などの遺伝子改変は、癌細胞培養において、明確な幹細胞集団7および主要なシグナル伝達経路8への依存性が失われ得る。ゲノムプロファイルは、癌球培養においてより良い程度まで維持することができるが、原発性腫瘍2,3の遺伝子型を完全にミラーリングすることができない。直接の異形性移植は、インビトロ培養の影響を否定し、適切な微小環境を提供し、腫瘍開始細胞9,10の完全性を維持する。したがって、原発異種移植片は、将来の臨床試験5,11,12の合理的な設計を支援するために、標的剤を厳格に試験するための強力で関連性の高い前臨床モデルを表す。

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:211px;">
			Phosphate buffered saline
			</td>
			<td style="width:142px;">
			Life Technologies
			</td>
			<td style="width:140px;">
			14040-133
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:211px;">
			Papain dissociation system
			</td>
			<td style="width:142px;">
			Worthington Biochemical Corp.
			</td>
			<td style="width:140px;">
			LK003150
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:211px;">
			Trypan blue solution 0.4%
			</td>
			<td style="width:142px;">
			Life Technologies
			</td>
			<td style="width:140px;">
			15250061
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:211px;">
			Ketamine HCl
			</td>
			<td rowspan="4" style="width:142px;">
			Obtained from institutional pharmacy or local veterinary supply company
			</td>
			<td style="width:140px;">
			
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:211px;">
			Xylazine HCl
			</td>
			<td style="width:140px;">
			
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:211px;">
			Ketoprofen
			</td>
			<td style="width:140px;">
			
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:211px;">
			Ophthalmic ointment
			</td>
			<td style="width:140px;">
			
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:211px;">
			Povidone-iodine
			</td>
			<td style="width:142px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:140px;">
			190061617
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:211px;">
			Cryopreservation medium and proliferation supplement
			</td>
			<td style="width:142px;">
			StemCell Technologies
			</td>
			<td style="width:140px;">
			05751
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:211px;">
			0.2% Heparin sodium salt in PBS
			</td>
			<td style="width:142px;">
			StemCell Technologies
			</td>
			<td style="width:140px;">
			07980
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:211px;">
			Penicillin-streptomycin
			</td>
			<td style="width:142px;">
			Life Technologies
			</td>
			<td style="width:140px;">
			15140-122
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:211px;">
			Dimethyl sulfoxide
			</td>
			<td style="width:142px;">
			Sigma-Aldrich
			</td>
			<td style="width:140px;">
			D6250-5X10ML
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:211px;">
			NOD.Cg-Prkdcscid I/2rgtm1Wjl/SzJ mice
			</td>
			<td style="width:142px;">
			The Jackson Laboratory
			</td>
			<td style="width:140px;">
			005557
			</td>
			<td style="width:97px;">
			NSG mice
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:211px;">
			Anti-human vimentin antibody
			</td>
			<td style="width:142px;">
			Dako
			</td>
			<td style="width:140px;">
			M7020
			</td>
			<td style="width:97px;">
			Use 1:200 to 1:800
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:211px;">
			Anti-human IDH1 R132H antibody
			</td>
			<td style="width:142px;">
			Dianova
			</td>
			<td style="width:140px;">
			DIA-H09
			</td>
			<td style="width:97px;">
			Use 1:100 to 1:400
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>




<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Material 
			</td>
			<td style="width:140px;">
			Company
			</td>
			<td style="width:143px;">
			Catalogue Number
			</td>
			<td style="width:97px;">
			Comments
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Centrifuge with swinging bucket rotor
			</td>
			<td style="width:140px;">
			
			</td>
			<td style="width:143px;">
			
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Pipetter with dispensing speed control
			</td>
			<td style="width:140px;">
			
			</td>
			<td style="width:143px;">
			
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Disposable hemocytometer
			</td>
			<td style="width:140px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:143px;">
			22-600-100
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Sterile surgical gloves
			</td>
			<td style="width:140px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:143px;">
			11-388128
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Disposable gown
			</td>
			<td style="width:140px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:143px;">
			18-567
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Surgical mask
			</td>
			<td style="width:140px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:143px;">
			19-120-1256
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Tuberculin syringe
			</td>
			<td style="width:140px;">
			BD
			</td>
			<td style="width:143px;">
			305620
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Alcohol pads
			</td>
			<td style="width:140px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:143px;">
			22-246-073
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Portable electronic scale
			</td>
			<td style="width:140px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:143px;">
			01-919-33
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Zoom stereomicroscope
			</td>
			<td style="width:140px;">
			
			</td>
			<td style="width:143px;">
			
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Surgical clipper
			</td>
			<td style="width:140px;">
			Stoelting
			</td>
			<td style="width:143px;">
			51465
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Scalpel handle
			</td>
			<td style="width:140px;">
			Fine Science Tools
			</td>
			<td style="width:143px;">
			10003-12
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Scalpel blades, #10
			</td>
			<td style="width:140px;">
			
			</td>
			<td style="width:143px;">
			
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Stereotaxic instrument
			</td>
			<td style="width:140px;">
			Stoelting
			</td>
			<td style="width:143px;">
			51730
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			High-speed drill
			</td>
			<td style="width:140px;">
			Stoelting
			</td>
			<td style="width:143px;">
			51449
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">Drill bit, 0.6 mm</td>
			<td style="width:140px;">Stoelting</td>
			<td style="width:143px;">514552</td>
			<td style="width:97px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Hamilton syringe
			</td>
			<td style="width:140px;">
			Hamilton
			</td>
			<td style="width:143px;">
			80336
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Autoclip, 9 mm
			</td>
			<td style="width:140px;">
			BD
			</td>
			<td style="width:143px;">
			427630
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Circulating water warming pad
			</td>
			<td style="width:140px;">
			Kent Scientific
			</td>
			<td style="width:143px;">
			TP-700
			TP-1215EA
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Hot bead dry sterilizer
			</td>
			<td style="width:140px;">
			Kent Scientific
			</td>
			<td style="width:143px;">
			INS300850
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Surgical scissors
			</td>
			<td style="width:140px;">
			Fine Science Tools
			</td>
			<td style="width:143px;">
			14101-14
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Fine scissors
			</td>
			<td style="width:140px;">
			Fine Science Tools
			</td>
			<td style="width:143px;">
			14094-11
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Spring scissors
			</td>
			<td style="width:140px;">
			Fine Science Tools
			</td>
			<td style="width:143px;">
			15018-10
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Dumont forceps
			</td>
			<td style="width:140px;">
			Fine Science Tools
			</td>
			<td style="width:143px;">
			11251-30
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Semimicro spatulas
			</td>
			<td style="width:140px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:143px;">
			14374
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Mouse brain slicer matrix
			</td>
			<td style="width:140px;">
			Zivic Instruments
			</td>
			<td style="width:143px;">
			BSMAS002-1
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:210px;">
			Cryogenic storage vials
			</td>
			<td style="width:140px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:143px;">
			12-567-501
			</td>
			<td style="width:97px;">
			
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary orthotopic glioma xenografts recapitulate infiltrative growth and isocitrate dehydrogenase i mutation

悪性神経膠腫は、臨床的および分子的特徴が異なる非常に浸透性の高いグリア新生物の不均一なグループを構成する。原発性異形移植片は、前臨床動物モデルにおける悪性神経膠腫サブタイプの組織病理学的および分子的特徴を再現する。移植アッセイでIIIおよびIV悪性神経膠腫を採点するWHOをモデル化するために、ヒト腫瘍細胞は免疫不全マウスの同位体部位、脳に異種移植される。培養した腫瘍細胞を利用する二次異種移植片とは対照的に、ヒトグリオーマ細胞は切除標本から解離され、組織培養で事前に通過せずに移植され、原発性異種移植片を生成する。この報告書の手順は、腫瘍サンプル調製、免疫不全マウスへの頭蓋内移植、腫瘍生着および腫瘍収穫のモニタリングを詳述し、その後のレシピエント動物への通過または分析を行う。腫瘍細胞の調製は2時間を必要とし、外科的処置は20分/動物を必要とする。

解剖したグリオーマ細胞は、免疫不全マウスの脳に直接移植され、一次異形移植ラインを得る。各腫瘍標本には、保護された健康情報を除去する識別プロセスの一環として、移植前に無作為化数が割り当てられる。この目的のために、5桁のREDcapデータベース番号を使用します。 図1 は、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ1(IDH1)変異アルギニン132をヒスチジン(R132H)と共に神経膠芽腫(G...

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Primary Orthotopic Glioma Xenografts Recapitulate Infiltrative Growth and Isocitrate Dehydrogenase I Mutation

悪性神経膠腫は、臨床的および分子的特徴が異なる非常に浸透性の高いグリア新生物の不均一なグループを構成する。原発性異形移植片は、前臨床動物モデルにおける悪性神経膠腫サブタイプの組織病理学的および分子的特徴を再現する。

原発性異形性神経膠腫は浸潤性の増殖とイソクエンテインゲナーゼI突然変異

Malignant gliomas constitute a heterogeneous group of highly infiltrative glial neoplasms with distinct clinical and molecular features. Primary ...

primary-orthotopic-glioma-xenografts-recapitulate-infiltrative-growth

Research

JoVE Journal

Medicine

7.9K ビュー.  Vanderbilt University Medical Center. 悪性神経膠腫は、臨床的および分子的特徴が異なる非常に浸透性の高いグリア新生物の不均一なグループを構成する。原発性異形移植片は、前臨床動物モデルにおける悪性神経膠腫サブタイプの組織病理学的および分子的特徴を再現する。

ビデオ: Primary Orthotopic Glioma Xenografts Recapitulate Infiltrative Growth and Isocitrate Dehydrogenase I Mutation

An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and subsequent cell adhesion. After their bladders are transurethrally catheterized and drained, animals are again catheterized to permit insertion of a platinum wire into bladders without damaging the urethra or bladder. The catheters are made of Teflon to serve as an insulator for the wire, which will conduct electrical current into the bladder to create a burn injury. An electrocautery unit is used to deliver 2.5W to the exposed end of the wire, burning away extracellular layers and providing attachment sites for carcinoma cells that are delivered in suspension to the bladder through a subsequent catheterization. Cells remain in the bladder for 90 minutes, after which the catheters are removed and the bladders allowed to drain naturally. The development of tumor is monitored via ultrasound. Specific attention is paid to the catheterization technique in the accompanying video.

Bladder tumors are established in female mice in a minimally invasive fashion through catheterization, local cauterization, and subsequent adhesion of carcinoma cells to the burn sites.

マウス膀胱癌の同所性モデル

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and ...

医学

Orthotopic Small Bowel Transplantation in Rats

Small bowel transplantation has become an accepted clinical option for patients with short gut syndrome and failure of parenteral nutrition (irreversible intestinal failure). In specialized centers improved operative and managing strategies have led to excellent short- and intermediate term patient and graft survival while providing high quality of life 1,3. Unlike in the more common transplantation of other solid organs (i.e. heart, liver) many underlying mechanisms of graft function and immunologic alterations induced by intestinal transplantation are not entirely known6,7. Episodes of acute rejection, sepsis and chronic graft failure are the main obstacles still contributing to less favorable long term outcome and hindering a more widespread employment of the procedure despite a growing number of patients on home parenteral nutrition who would potentially benefit from such a transplant. The small intestine contains a large number of passenger leucocytes commonly referred to as part of the gut associated lymphoid system (GALT) this being part of the reason for the high immunogenity of the intestinal graft. The presence and close proximity of many commensals and pathogens in the gut explains the severity of sepsis episodes once graft mucosal integrity is compromised (for example by rejection). To advance the field of intestinal- and multiorgan transplantation more data generated from reliable and feasible animal models is needed. The model provided herein combines both reliability and feasibility once established in a standardized manner and can provide valuable insight in the underlying complex molecular, cellular and functional mechanisms that are triggered by intestinal transplantation. We have successfully used and refined the described procedure over more than 5 years in our laboratory 8-11. The JoVE video-based format is especially useful to demonstrate the complex procedure and avoid initial pitfalls for groups planning to establish an orthotopic rodent model investigating intestinal transplantation.

Small bowel transplantation has become an accepted treatment option for patients with irreversible intestinal failure. Our experimental model of orthotopic small bowel transplantation in rats serves as a reliable tool to address underlying immunologic and inflammatory processes that complicate intestinal transplantation.

ラット同所性小腸移植

Small  bowel transplantation has become an accepted clinical option for patients with  short gut syndrome and failure of parenteral nutrition ...

Orthotopic Liver Transplantation in Rats

Clinical progress in the field of liver transplantation has been largely supported by animal models1,2. Since the publication of the first orthotopic rat liver transplantation in 1979 by Kamada et al.3, this model has remained the gold standard despite various proposed alternative techniques4. Nevertheless, its broader use is limited by its steep learning curve5.
In this video paper, we show a simple and easy-to-establish revision of Kamada's two-cuff technique. The suprahepatic vena cava anastomosis is performed manually with a running suture, and the vena porta and infrahepatic vena cava anastomoses are performed utilizing a quick-linker cuff system6. Manufacturing the quick-linker kit is shown in a separate video paper.

We present an easy-to-establish revision of the classical two-cuff technique for orthotopic liver transplantation in rat.

ラット同所性肝移植

Clinical progress in the field of liver transplantation has been largely supported by animal models1,2. Since the publication of the first orthotopic rat ...

Imaging Glioma Initiation In Vivo Through a Polished and Reinforced Thin-skull Cranial Window

Glioma is the one of the most lethal forms of human cancer. The most effective glioma therapy to date-surgery followed by radiation treatment-offers patients only modest benefits, as most patients do not survive more than five years following diagnosis due to glioma relapse 1,2. The discovery of cancer stem cells in human brain tumors holds promise for having an enormous impact on the development of novel therapeutic strategies for glioma 3. Cancer stem cells are defined by their ability both to self-renew and to differentiate, and are thought to be the only cells in a tumor that have the capacity to initiate new tumors 4. Glioma relapse following radiation therapy is thought to arise from resistance of glioma stem cells (GSCs) to therapy 5-10. In vivo, GSCs are shown to reside in a perivascular niche that is important for maintaining their stem cell-like characteristics 11-14. Central to the organization of the GSC niche are vascular endothelial cells 12. Existing evidence suggests that GSCs and their interaction with the vascular endothelial cells are important for tumor development, and identify GSCs and their interaction with endothelial cells as important therapeutic targets for glioma. The presence of GSCs is determined experimentally by their capability to initiate new tumors upon orthotopic transplantation 15. This is typically achieved by injecting a specific number of GBM cells isolated from human tumors into the brains of severely immuno-deficient mice, or of mouse GBM cells into the brains of congenic host mice. Assays for tumor growth are then performed following sufficient time to allow GSCs among the injected GBM cells to give rise to new tumors-typically several weeks or months. Hence, existing assays do not allow examination of the important pathological process of tumor initiation from single GSCs in vivo. Consequently, essential insights into the specific roles of GSCs and their interaction with the vascular endothelial cells in the early stages of tumor initiation are lacking. Such insights are critical for developing novel therapeutic strategies for glioma, and will have great implications for preventing glioma relapse in patients. Here we have adapted the PoRTS cranial window procedure 16and in vivo two-photon microscopy to allow visualization of tumor initiation from injected GBM cells in the brain of a live mouse. Our technique will pave the way for future efforts to elucidate the key signaling mechanisms between GSCs and vascular endothelial cells during glioma initiation.

Imaging Glioma Initiation In Vivo Through a Polished and Reinforced Thin-skull Cranial Window

By combining a polished and reinforced thin-skull (PoRTS) cranial window and glioblastoma (GBM) cell injection, we can observe glioma initiation and growth from injected GBM cells in the brain of a live mouse longitudinally.

イメージンググリオーマ開始<emインビボで&gt;</em&gt;ポリッシュと補強シン頭蓋骨頭蓋窓スルー

Glioma is the one of the most lethal forms of human cancer. The most effective glioma therapy to date-surgery followed by radiation treatment-offers ...

An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder tumor model. The mouse model is established by urethral catheterization under inhaled general anesthetic. Chemical burn is then introduced to the bladder mucosa using intravesical silver nitrate solution to disrupt the bladder glycosaminoglycan layer and allows cells to attach. Following several washes with sterile water, human bladder cancer KU-7-luc2-GFP cells are instilled through the catheter into the bladder to dwell for 2 hours. Subsequent growth of bladder tumors is confirmed and monitored by in vivo bladder ultrasound and bioluminescent imaging. The tumors are then treated intravesically with saRNA formulated in lipid nanoparticles (LNPs). Tumor growth is monitored with ultrasound and bioluminescence. All steps of this procedure are demonstrated in the accompanying video.

Establishing an orthotopic bladder tumor model to evaluate antitumor effects of intravesically delivered saRNA and monitoring tumor growth by ultrasound and bioluminescent imaging.

同所性膀胱腫瘍モデルと膀胱内Sarnaの治療の評価

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder ...

Fetal Echocardiography and Pulsed-wave Doppler Ultrasound in a Rabbit Model of Intrauterine Growth Restriction

Fetal intrauterine growth restriction (IUGR) results in abnormal cardiac function that is apparent antenatally due to advances in fetoplacental Doppler ultrasound and fetal echocardiography. Increasingly, these imaging modalities are being employed clinically to examine cardiac function and assess wellbeing in utero, thereby guiding timing of birth decisions. Here, we used a rabbit model of IUGR that allows analysis of cardiac function in a clinically relevant way. Using isoflurane induced anesthesia, IUGR is surgically created at gestational age day 25 by performing a laparotomy, exposing the bicornuate uterus and then ligating 40-50% of uteroplacental vessels supplying each gestational sac in a single uterine horn. The other horn in the rabbit bicornuate uterus serves as internal control fetuses. Then, after recovery at gestational age day 30 (full term), the same rabbit undergoes examination of fetal cardiac function. Anesthesia is induced with ketamine and xylazine intramuscularly, then maintained by a continuous intravenous infusion of ketamine and xylazine to minimize iatrogenic effects on fetal cardiac function. A repeat laparotomy is performed to expose each gestational sac and a microultrasound examination (VisualSonics VEVO 2100) of fetal cardiac function is performed. Placental insufficiency is evident by a raised pulsatility index or an absent or reversed end diastolic flow of the umbilical artery Doppler waveform. The ductus venosus and middle cerebral artery Doppler is then examined. Fetal echocardiography is performed by recording B mode, M mode and flow velocity waveforms in lateral and apical views. Offline calculations determine standard M-mode cardiac variables, tricuspid and mitral annular plane systolic excursion, speckle tracking and strain analysis, modified myocardial performance index and vascular flow velocity waveforms of interest. This small animal model of IUGR therefore affords examination of in utero cardiac function that is consistent with current clinical practice and is therefore useful in a translational research setting.

We describe examination of fetal cardiac function with contemporary functional fetal echocardiography and fetoplacental Doppler ultrasound using the VisualSonics VEVO 2100 microultrasound in a surgically induced model of intrauterine fetal growth restriction in a rabbit.

胎児心エコー検査と子宮内発育制限のウサギモデルにおけるパルス波ドップラー超音波

Fetal intrauterine growth restriction (IUGR) results in abnormal cardiac function that is apparent antenatally due to advances in fetoplacental Doppler ...

Bioluminescent Orthotopic Model of Pancreatic Cancer Progression

Pancreatic cancer has an extremely poor five-year survival rate of 4-6%. New therapeutic options are critically needed and depend on improved understanding of pancreatic cancer biology. To better understand the interaction of cancer cells with the pancreatic microenvironment, we demonstrate an orthotopic model of pancreatic cancer that permits non-invasive monitoring of cancer progression. Luciferase-tagged pancreatic cancer cells are resuspended in Matrigel and delivered into the pancreatic tail during laparotomy. Matrigel solidifies at body temperature to prevent leakage of cancer cells during injection. Primary tumor growth and metastasis to distant organs are monitored following injection of the luciferase substrate luciferin, using in vivo imaging of bioluminescence emission from the cancer cells. In vivo imaging also may be used to track primary tumor recurrence after resection. This orthotopic model is suited to both syngeneic and xenograft models and may be used in pre-clinical trials to investigate the impact of novel anti-cancer therapeutics on the growth of the primary pancreatic tumor and metastasis.

Improved understanding of pancreatic cancer biology is critically needed to enable the development of better therapeutic options to treat pancreatic cancer. To address this need, we demonstrate an orthotopic model of pancreatic cancer that permits non-invasive monitoring of cancer progression using in vivo bioluminescence imaging.

膵臓癌の進行の生物発光同所性モデル

Pancreatic cancer has an extremely poor five-year survival rate of 4-6%.  New therapeutic options are critically needed and depend on improved ...

Generation of Subcutaneous and Intrahepatic Human Hepatocellular Carcinoma Xenografts in Immunodeficient Mice

In vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate the human disease provide a valuable platform for research into disease pathophysiology and for the preclinical evaluation of novel therapies. We present a variety of methods to generate subcutaneous or orthotopic human HCC xenografts in immunodeficient mice that could be utilized in a variety of research applications. With a focus on the use of primary tumor tissue from patients undergoing surgical resection as a starting point, we describe the preparation of cell suspensions or tumor fragments for xenografting. We describe specific techniques to xenograft these tissues i) subcutaneously; or ii) intrahepatically, either by direct implantation of tumor cells or fragments into the liver, or indirectly by injection of cells into the mouse spleen. We also describe the use of partial resection of the native mouse liver at the time of xenografting as a strategy to induce a state of active liver regeneration in the recipient mouse that may facilitate the intrahepatic engraftment of primary human tumor cells. The expected results of these techniques are illustrated. The protocols described have been validated using primary human HCC samples and xenografts, which typically perform less robustly than the well-established human HCC cell lines that are widely used and frequently cited in the literature. In comparison with cell lines, we discuss factors which may contribute to the relatively low chance of primary HCC engraftment in xenotransplantation models and comment on technical issues that may influence the kinetics of xenograft growth. We also suggest methods that should be applied to ensure that xenografts obtained accurately resemble parent HCC tissues.

Human tumor xenografts in immunodeficient mice are valuable tools to study cancer biology. Specific protocols to generate subcutaneous and intrahepatic xenografts from human hepatocellular carcinoma cells or tumor fragments are described. Liver regeneration induced by partial hepatectomy in recipient mice is presented as a strategy to facilitate intrahepatic engraftment.

免疫不全マウスの皮下および肝内ヒト肝細胞癌異種移植片の生成

In  vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate  the human disease provide a valuable platform for research into disease  ...

Minimally Invasive Establishment of Murine Orthotopic Bladder Xenografts

Orthotopic bladder cancer xenografts are the gold standard to study molecular cellular manipulations and new therapeutic agents&#160;in vivo. Suitable cell lines are inoculated either by intravesical instillation (model of nonmuscle invasive growth) or intramural injection into the bladder wall (model of invasive growth). Both procedures are complex and highly time-consuming. Additionally, the superficial model has its shortcomings due to the lack of cell lines that are tumorigenic following instillation. Intramural injection, on the other hand, is marred by the invasiveness of the procedure and the associated morbidity for the host mouse.
With these shortcomings in mind, we modified previous methods to develop a minimally invasive approach for creating orthotopic bladder cancer xenografts. Using ultrasound guidance we have successfully performed percutaneous inoculation of the bladder cancer cell lines UM-UC1, UM-UC3 and UM-UC13 into 50 athymic nude. We have been able to demonstrate that this approach is time efficient, precise and safe. With this technique, initially a space is created under the bladder mucosa with PBS, and tumor cells are then injected into this space in a second step. Tumor growth is monitored at regular intervals with bioluminescence imaging and ultrasound. The average tumor volumes increased steadily in in all but one of our 50 mice over the study period.
In our institution, this novel approach, which allows bladder cancer xenograft inoculation in a minimally-invasive, rapid and highly precise way, has replaced the traditional model.

The established technique to inoculate primary invasive orthotopic bladder cancer xenografts requires laparotomy and mobilization of the bladder. This procedure inflicts significant morbidity on the mice, is technically challenging and time-consuming. We therefore developed a high-precision, percutaneous approach utilizing ultrasound guidance.

マウス同所性膀胱異種移植片の最小侵襲性の確立

Orthotopic bladder cancer xenografts are the gold standard to study molecular cellular manipulations and new therapeutic agents&#160;in vivo. Suitable ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.