Cas9要素を安全かつ効果的に細胞に送達することは、遺伝子編集に基づく治療法にとって非常に重要です。ここで示すプロトコルは、その方向に新しいアプローチを示しています。このプロトコルは、チューブエレクトロポレーションと呼ばれる新しいエレクトロポレーション法を利用しています。
これは、高い細胞生存率だけでなく、遺伝子編集率につながります.チューブエレクトロポレーション法は、ウイルス、薬物、レポーター濃縮フリーです。これらは臨床用途で好まれるので、遺伝子編集ベースの治療法で好まれる。
この方法は、多くのセル型に共通して適用されます。例えば、ヒト造血細胞、原発性T細胞、および他の細胞はすべて、我々の方法を使用して編集することができる。このチューブエレクトロポレーション法は、薄いチューブを使用します。
初めてのユーザーの場合は、プラスミドDNAを発現するGFPを試すことができます。手順を実証するリンユアン・マ、私の研究室からのポスドクです。この手順を開始するには、アメリカンタイプカルチャーコレクションからヒトiPSCを取得します。
供給者の指示に従って5%の二酸化炭素を摂氏37度で細胞培養器内のフィーダーフリー細胞培養培地で人工細胞外マトリックス上のiPSCを培養する。トランスフェクションの2時間前に、タンパク質キナーゼ阻害剤Y-27632を含む10マイクロモルRho関連コイルドコイルでiPSCを治療します。トランスフェクト時に、細胞剥離液でiPSCを37°Cの単一細胞に5分間解離する。
次に、セルの数を数えます。ウサギ線維芽細胞培養を確立するために、ウサギの耳の先端から耳皮膚生検を得る。5%ペニシリンストレプトマイシンを含むDPBSで組織を2回リンスする。
すすった耳の組織を新しい6センチメートルの組織培養皿に移し、組織を小さく切り、それぞれ約1ミリメートルずつ切ります。組織が乾燥するのを防ぐために、FBSを数滴加えます。この後、細断された組織を10センチメートルの組織培養皿に広げ、10ミリリットルの培養培地を加える。
3~5日間、5%の二酸化炭素で37°Cの細胞をインキュベートします。めっきの3~5日後にトリプシン-EDTAを使用して37°Cで細胞を2分間消化し、細胞数を数えます。gRNAおよびドナーオリゴを設計・合成した後、先に述べたように細胞を調製する。
20~30,000個の細胞を20マイクロリットルのエレクトロポレーションバッファーに再懸濁します。ピペットは慎重に上下して単一の細胞懸濁液を作り出す。Cas9 RNP トランスフェクションの場合、Cas9 NLS タンパク質の 2 マイクログラムを室温で 0.67 マイクログラムの gRNA を 10 ~ 15 分間事前に混合します。
形成されたRNP複合体を2マイクログラムのssODNと細胞と穏やかに混合する。エレクトロポレーションキットから普遍的なピペットチップを使用して、20マイクロリットルのエレクトロポレーションチューブに細胞混合物を移します。エレクトロポレーションチューブをエレクトロポレーターのスロットに入れ、最後まで押します。
エレクトロポレーションサイクルが成功した場合、エレクトロポレーターの表示画面のパルスレポートによって示されます。エレクトロポレーション後、ヒトiPS細胞を、先に述べたように予め温めたY-27632含有培地の1ミリリットルに移す。その後、再懸濁した細胞を12ウェルの細胞培養プレートの1つのウェルにプレートします。
プレートを培養し続け、毎日培養培地を変更するようにします。Y-27632は、24時間後のエレクトロポレーション後のヒトiPSC培地から除去される。エレクトロポレーションの72時間後、細胞を収穫する。
ウサギ線維芽細胞の場合、トリプシン-EDTAを使用して培養プレートから細胞を消化します。ヒトのiPSCでは、細胞剥離液を使用して培養プレートから細胞を消化します。サンプルを1000rpmで5分間短く遠心し、350ミリリットルのリシスバッファーで細胞を再懸濁させる。
摂氏55度で一晩インキュベート。翌日、標準的な手順を用いてフェノールクロロホルムでゲノムDNAを抽出します。ゲル抽出キットを使用するか、PCR SV ミニキットを使用して PCR 製品から直接 100 ~ 200 塩基ペアの DNA フラグメントを増幅します。
細菌コロニーシーケンシングによる遺伝子編集効率を決定するには、TOPO-TAクローニングキットを使用して、精製PCR産物をPCR4-TOPOベクターにリゲートします。TOPO-TAクローニングキットによって提供される普遍的なシーケンシングプライマーを使用して、細菌クローンをランダムにピックアップし、挿入物を配列します。深いシーケンシングによる遺伝子編集効率を決定するために、DNAシーケンシングコア内でCRISPRアンプリコンシーケンシング用に、以前に得られた精製PCR産物を送ります。
本研究では、チューブエレクトロポレーション法を用いて、CRISPR/Cas9 RNPおよびssODNをウサギおよびヒト細胞に送達し、堅牢で正確な遺伝子編集を行う。まず、C231YおよびQ235X突然変異はIL2RG遺伝子で産生され、そしてウサギ線維芽細胞のSPR遺伝子においてR150G変異が生じる。細菌TAクローニングによって決定される特異的なsgRNA設計および遺伝子編集率をここに示す。
IL2RG C231遺伝子座は、配列された28クローンのうち、1つは正確なC231Y突然変異を運び、4つは挿入または欠失突然変異を運び、残りの23は野生型である。IL2RG Q235遺伝子座では、配列された27クローンのうち、2つは正確なQ235X突然変異を運び、3つはインデル突然変異を運び、残りは野生型である。SPG R150遺伝子座では、配列された20クローンのうち、5個が正確なR150遺伝子変異を運び、10個はインデル突然変異を運び、残りは野生型である。
チューブエレクトロポレーションは、Cas9 RNPおよびssODNをヒトiPSCに送達し、EGFR、Mybpc3、およびHBB遺伝子の臨床的に関連する遺伝子を標的にするために使用されます。EGFR遺伝子座では、対立遺伝子の15.68%が正確な点突然変異を有し、22.75%がインデル突然変異を有し、残りの61.57%が野生型である。Mybpc3遺伝子座では、37.92%が正確な4つの塩基対TGAA欠失を運び、2.24%がインデル突然変異を運び、残りの59.84%は野生型である。
HBB遺伝子座では、11.5%が正確なE6V突然変異を運び、35.4%がインデル突然変異を運び、残りの65%は野生型である。Cas9 RNPは、プラスミドDNAと比較してその小さいサイズのためにCas9の好ましい形態である。管のエレクトロポレーションはCas9 RNPを送達する有効な方法である。
CAR Tアプリケーション用の一次T細胞におけるCas9 RNPのチューブエレクトロポレーションの利用に特に関心を持っています。
