このプロトコルは、正常な筋原性前駆細胞由来のエクソンを移植することによって、デュシェンヌの筋ジストロフィーマウスにおける心機能を移行的に改善する方法を提示する。外皮移植は、レシピエント心臓におけるジストロフィーの発現増加に関連してDMDマウスの心臓機能を改善することができる。エキサの分離、精製、筋膜内移植のための適切な方法は、デュシェンヌの筋ジストロフィーを有するマウスの心臓機能を改善するために、エクソン移植の成功に寄与する。
MPC由来のエキソソーム療法は、外因性媒介性正常なジストロフィンmRNA転移によって骨格筋機能を改善する可能性がある。このビデオでは、外因性精製、心筋外因性分娩、および心エコー検査後移植のための重要な技術を示す。心エコー検査のデモンストレーションは、研究室の技術者であるヤン・シェンによって行われます。
この手順を開始するには、500万個のC2C12細胞を15センチメートルの培養皿に種付けし、10%FBSと抗生物質を含む完全なDMEMを20ミリリットルで培養します。5%の二酸化炭素で摂氏37度でインキュベートする。次に、スイングバケットローターを使用して、100,000倍GでFBSを超遠心分離し、摂氏4度で18時間使用して、エキソソーム枯渇培地を調製します。
ペレットを捨てて上清を集める。単層細胞が培養皿中で80%の合流に達したら、完全なDMEMをエキソソーム枯渇培地に置き換えます。移管ピペットを使用して、48時間ごとに細胞培養皿から上清を収集します。
チューブを150回Gで10分間遠心し、残りの細胞を除去する。上清を0.22マイクロメートルのフィルターでフィルターして、細胞の破片を除去し、フィルターした媒体を超透明の管に移します。次に、スイングバケットローターを使用して、チューブを100、00倍G、摂氏4度で120分間超遠心分離し、エキソソームを沈殿させます。
PBS中のエキソソーム含有ペレットを再懸濁し、超透明チューブ全体をPBSで満たします。この懸濁液を100,00倍Gで、摂氏4度で120分間超遠心分離し、汚染タンパク質を排除します。上清を捨て、100マイクロリットルのPBSでエキソソームペレットを再懸濁します。
将来の使用のためにマイナス80°Cで保管してください。まず、各手足をテープで固定することにより、手術用プラットフォーム上の上の上の位置に麻酔をしたマウスを固定する。上の歯の下に3-0縫合糸を水平に置き、上顎を所定の位置に保持します。
次に、マウスの胸の左側に脱毛クリームを塗布し、皮膚からモミを取り除きます。24ゲージのカテーテルを使用して、口腔を介して気管内挿管を行う。そして、1分間に195呼吸の速度で部屋の空気でマウスを換気するためにげっ歯類の換気装置を使用してください。
70%アルコールと10%ポビドネヨウ素で皮膚を消毒します。その後、左胸骨端から左脇の下まで10〜15ミリメートル斜め切開を行います。はさみを使用して大胸筋と小胸部をカットします。
そして、4番目の沿岸間空間を通って左の分腔序を作ります。左肺に損傷を与えないので、胸腔を10ミリメートルの幅に広げるために、レトラクタバンドをそっと挿入します。この後、2つのストレートピンセットを使用して心膜を取り除きます。
それらを引き離し、心臓を露出させるためにリトラクターの先端の後ろにそれらを置きます。31ゲージのインスリン針を使用して、MPC-ExoまたはPBSのいずれかの心膜内を1つの部位の左心室の前壁に注入する。次に、6-0ナイロン縫合糸を使用して胸腔、胸筋、および皮膚を順番に閉じます。
PBSエキソソーム移植の2日後、テキストプロトコルに概説されているようにマウスを麻酔する。テープを使用して、マウスを上弦の位置に固定し、左胸部に予熱された音響ゲルを塗布します。次に、心エコー検査を使用して左心室機能を評価する。
左心室のパラスターナル長軸図を2次元で取得し、次いで超音波プローブを90度回転させて、乳頭筋レベルで左心室短軸図を得る。この後、Mモード心エコー画像を記録し、左心室終期拡張期直径、左心室終期収縮期容積、左心室終期期容積、および左心室末期収縮期容積を測定する。マウスの心拍数は、心臓測定機能のために少なくとも400bpmを制御する必要があります。
エキソソームをC2C12細胞から単離して精製した後、透過電子顕微鏡分析を用いてその存在が確認される。透過電子顕微鏡画像は、C2C12由来エキソソームの明るい円形の小胞の形態を示す。ウェスタンブロット分析は、CD63およびTsg101を含むエキソソームマーカーの存在を確認する。
半透明浮腫領域は、心筋への注入が成功したことを示すmdxマウスの左心室の前心壁への心筋内注入後に観察される。次いで、ジストロフィンの免疫蛍光染色を行い、心臓MPC-Exo送達がMDX心臓におけるジストロフィンタンパク質発現を回復させるかどうかを判断する。ジストロフィン発現の部分的な回復は、心筋細胞の一部における膜局在化で観察される。
心機能は、心筋内出産の2日後に心エコー検査によって測定され、MPC-Exoのトランスプロレーションがmdxマウスの心機能を改善するかどうかを決定する。MPC-Exo治療はPBSと比較して内壁の動きを改善することが見られ、MPC-Exo移植がmdxマウスの心臓機能を改善したことを示唆している。約20度の先端で31ゲージのインスリン針を使用することは、心筋薬へのほとんどのエキソソームの送達に成功するために重要であり、心筋細胞をホストするために注入されたエキソソームの暴露を最大化する。
手順に従って、ジストロフィン発現は、MPC由来エキソソーム送達がジストロフィンタンパク質発現を回復することを示す免疫蛍光染色法によるMPC由来エキソソーム注射後に検出することができる。この技術は、DNA、mRNA、lncRNA、またはマイクロRNAを含むエキソソームを運ぶ治療遺伝物質による心筋症治療への道を開く。
