Este protocolo apresenta o método para melhorar transicionalmente a função cardíaca nos camundongos de distrofia muscular de Duchenne, transplantando exon derivado de células progenitoras miogênicas normais. O transplante exosmal pode melhorar a função cardíaca em camundongos DMD em associação com o aumento da expressão de distrofia em corações receptores. Método apropriado para isolamento de exon, purificação e transplante intramialárdico contribuem para o sucesso do transplante de exon para melhorar a função cardíaca para camundongos com a distrofia muscular de Duchenne.
A terapia exososome derivada do MPC pode melhorar a função muscular esquelética pela transferência normal de distrofina mRNA mediada por distropina. Este vídeo demonstra as técnicas críticas para purificação exósia, parto exossomo intramocárdio e pós-transplante de ecocardiografia. A demonstração da ecocardiografia será feita por Yan Shen, técnico do nosso laboratório.
Para iniciar este procedimento, semente cinco milhões de células C2C12 em um prato de cultura de 15 centímetros com 20 mililitros de DMEM completo contendo 10% FBS e antibióticos. Incubar a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Em seguida, use um rotor de balde balançando para ultracentrifugar FBS a 100.000 vezes G e a quatro graus Celsius por 18 horas para preparar o meio exosome-esgotado.
Descarte a pelota e colete o supernasce. Quando as células monocamadas atingirem 80% de confluência no prato de cultura, substitua o DMEM completo por meio exossomo esgotado. Use uma pipeta de transferência para coletar o supernascedor do prato de cultura celular a cada 48 horas.
Centrifugar os tubos a 150 vezes G durante dez minutos para remover as células restantes. Filtre o supernatante através de um filtro de 0,22 micrômetro para eliminar quaisquer detritos celulares e transfira os tubos filtrados para ultra-claros. Em seguida, use um rotor de balde de balanço para ultracentrifugar os tubos a 100, 00 vezes G e a 4 graus Celsius por 120 minutos para precipitar os exossomos.
Resuspenha a pelota contendo exossomo na PBS e, em seguida, encha todo o tubo ultra-claro com PBS. Ultracentrizar esta suspensão a 100, 00 vezes G e a 4 graus Celsius por 120 minutos para eliminar proteínas contaminantes. Descarte o supernatante e resuspenja a pelota exososome em 100 microliters de PBS.
Armazene a menos 80 graus Celsius para uso futuro. Primeiro, conserte cada rato anestesiado na posição supina em uma plataforma cirúrgica, protegendo cada membro com fita. Coloque uma sutura 3-0 horizontalmente abaixo dos dentes superiores para manter a mandíbula superior no lugar.
Em seguida, aplique creme depilatório no lado esquerdo do peito do rato para remover o abeto da pele. Utilizando um cateter calibre 24, realize a intubação endotraqueal através da cavidade oral. E use um ventilador de roedores para ventilar o mouse com ar da sala a uma taxa de 195 respirações por minuto.
Desinfete a pele com 70% de álcool e 10% de iodo povidone. Em seguida, faça uma incisão oblíqua de 10 a 15 milímetros da borda popa esquerda para a axila esquerda. Use uma tesoura para cortar o peitoral maior e peitoral menor.
E faça uma thoracotamy esquerda através do quarto espaço intercostal. Insira suavemente faixas retráteis para espalhar a cavidade torácica a uma largura de 10 milímetros, tomando cuidado para não danificar o pulmão esquerdo. Depois disso, use duas pinças retas para remover o pericárdio.
Puxe-os separados e coloque-os atrás das pontas do retrátil para expor o coração. Use uma agulha de insulina calibre 31 para injetar mpc-exo ou PBS intramyocardially na parede anterior do ventrículo esquerdo em um local. Em seguida, use suturas de nylon 6-0 para fechar a cavidade torácica, os músculos peitoral e a pele, em sequência.
Dois dias após o transplante exossomo da PBS, anestesiar os camundongos conforme descrito no protocolo de texto. Use fita para fixar um mouse na posição supina e aplique gel acústico pré-aquecido na área do peito esquerdo. Em seguida, use ecocardiografia para avaliar a função ventricular esquerda.
Obtenha a visão do eixo longo parasténal do ventrículo esquerdo em duas dimensões e, em seguida, gire a sonda de ultrassom 90 graus para obter uma visão de eixo curto ventrículo esquerdo no nível muscular papilar. Depois disso, grave imagens ecocardiográficas do modo M e meça o diâmetro ventricular final-diastólico esquerdo, o volume ventricular esquerdo end-sistólico, o volume ventricular esquerdo final-diastólico e o volume ventricular esquerdo end-sistólica. A frequência cardíaca dos camundongos deve ser controlada pelo menos 400 bpm para a função de medição cardíaca.
Após exossomos serem isolados e purificados das células C2C12, sua presença é confirmada usando a análise de microscopia eletrônica de transmissão. A imagem de microscopia eletrônica de transmissão mostra a morfologia das vesículas brilhantes e redondas dos exosóis derivados de C2C12. A análise da mancha ocidental confirma a presença de marcadores exosóis, incluindo CD63 e Tsg101.
Uma área de edema translúcido é observada após a injeção intramiocárdia na parede anterior do ventrículo esquerdo de camundongos mdx, o que indica que a injeção no miocárdio é bem sucedida. A coloração imunofluorescente para distrofina é então realizada para determinar se o parto cardíaco MPC-Exo restaura a expressão de proteína de distrofina em corações mdx. A restauração parcial da expressão da distrofina é observada com localização de membrana em alguns cardiomiócitos.
A função cardíaca é medida pela ecocardiografia dois dias após a entrega intramocárida para determinar se a transplação do MPC-Exo melhora a função cardíaca em camundongos mdx. O tratamento MPC-Exo é visto para melhorar o movimento da parede interior em comparação com a PBS, sugerindo que o transplante MPC-Exo melhorou a função cardíaca em camundongos mdx. Usar uma agulha de insulina calibre 31 com a ponta a cerca de 20 graus é fundamental para o sucesso para a entrega da maioria dos exossomos no miocárdio e maximiza a exposição de exossomos injetados para hospedar cardiomócitos.
Após o procedimento, a expressão da distrofina pode ser detectada após a injeção exosóica derivada do MPC por manchas imunofluorescentes indicando que a entrega exosóica derivada de MPC cardíaco restaura a expressão de proteína de distrfina. Esta técnica abrirá caminho para o tratamento da cardiomiopatia com materiais genéticos terapêuticos exossomos, incluindo DNA, mRNA, lncRNA ou microRNAs.
