このプロトコルは、筋肉疾患のモデル化および前臨床治療試験の実施に使用できるヒト骨格筋異種移植片を作成するために使用できるため、重要である。この異種移植モデルは、研究者がヒトの筋肉細胞生物学をよりよく理解し、稀または後天性筋肉疾患の新しいモデルを開発するために生体内でヒトの筋肉を研究することを可能にする。ヒト筋肉生検を得た後、筋肉培地を含む100×15ミリメートルのペトリ皿に標本を入れ、ステレオ顕微鏡と手術用はさみを使用して残りの筋膜または脂肪組織を除去する。
筋肉生検を約7~3ミリメートルに解剖し、標本内に繊維が縦方向に配置されるように注意する。次に、解剖した筋肉を含むペトリ皿を氷の上に移し、合成の非吸収性縫合糸を70%エタノールの100ミリメートルのペトリ皿に入れます。生後8~12週でつま先ピンチに対する反応の欠如を確認した後、麻酔NOD-Rag-γマウスを麻酔し、免疫不全動物の目に軟膏を塗布し、トリマーを使用して脛取り前髪を足首から膝に上に引き出す。
次いで、ポビドネヨウ素溶液および70%エタノールで手術部位を消毒する前に、露出した皮膚に1分間脱毛クリームを塗布する。ヒト組織を移植するには、まずマウス脚をテープダウンし、遠位腱に由来し、膝の下に終端する脛骨前部の上にまっすぐ切開を行う。鈍い解剖を使用して筋肉組織から皮膚を分離し、はさみを使用して脛表筋のエピミシウムを通して0.5ミリメートル未満の切開を行い、腱から始まり、膝で終わる。
脛指前部の遠位腱を切断した後、虹彩鉗子で腱をつかみ、筋肉を膝に向かって引き上げる。次に、伸長体長間の遠位腱を切り、伸長体長膜を膝に向かって引き上げる。骨蓋長筋の近位腱が見えたら、伸長体の長体龍と脛骨前部をはさみで取り除きます。
PBSで濡れた外科的ワイプを使用して、止まりが達成されるまでわずかな圧力を加え、近位ペローヌス腱を通して縫合糸を通し、腱の両側に約1.5インチの糸を残します。2手の外科的正方形の結び目の前半を締め付けずに円を形成し、異種移植片を円に入れ、ループを締めて移植片組織を固定します。四角結び目の残りの半分を完了して、異種移植片を近位腱の長膜に縫合し、遠位腱を通して縫合糸を通して遠位腱で正方形の結び目のテクニックを繰り返します。
移植片の両端が固定されたら、異種移植筋肉の上に皮膚を引っ張り、外科的な接着剤で切開を密封し、接着剤の上に2〜3つの外科的ステープルを置く。次に、マウスを加熱されたパッドの清潔なケージに入れ、完全な再発まで監視します。手術後4~6ヶ月後、ゼノグラフト収穫の少なくとも30分間、ドライアイスの箱に200ミリリットルの2-メチルブタンを含む覆われたビーカーを入れる。
2-メチルブタンが冷却されたら、つま先ピンチに対する応答の欠如を確認し、トリマーと脱毛クリームで足首から膝に脛表の前部を覆う髪を取り除きます。異種移植片を所定の位置に保持する縫合糸は、皮膚を通して観察されるべきである。脚をテープで固定し、両縫合糸が発覚するまではさみと虹彩鉗子を使って異種移植片の上に皮膚を開きます。
メスを使って異種移植片と脛診の間を切断し、異種移植片の片側を解放してから、百腸筋と胃腸筋の間で切断する。遠位縫合糸の下と頸部の遠位腱を通して切り、虹彩鉗子を使用して縫合糸を膝に向かってつかみ、そらしながら、はさみを使用して外異移植片を根底にある筋肉組織から切り離します。次に、ハサミを使用して近位縫合糸の上に切り取り、異種移植片とペロネウスの龍を取り除き、収穫した標本を小さな段ボールの上に置きます。
筋肉を優しく伸ばしながら縫合糸にできるだけ近い組織を固定し、スナップ凍結プロセス中に繊維配向が維持されるようにします。ピンがしっかりと所定の位置にある場合は、筋肉をピンの上にスライドさせて組織が段ボールのすぐ上に置き、事前に冷却された2-メチルブタンの異種移植片をマイナス80°Cのストレージにスナップします。正常な異種移植片は、ヒト特異的抗体で同定されたヒト筋繊維の強い再生を示す。
筋線維の割合内での陽性胚性ミオシン染色は、再生プロセスがまだ進行中であることを示している。対照的に、手術技術が不十分であったり、不十分な標本が筋線維の再生不良を引き起こし得る。特発性炎症性筋腫と診断された患者から行われた異種移植片は、4ヶ月および6ヶ月のコレクションで適度な数の再生ヒト筋線維を示し、胚性筋シン染色は6ヶ月で持続する。
炎症性細胞は、異種移植片内にも存在し、HおよびE染色によって観察される。個々の筋繊維サイズは、特発性炎症性筋症異種移植片において4ヶ月から6ヶ月の間で類似している。3,500マイクロメートル平方メートルを超える断面面積を示す稀な繊維は、異種移植片内では観察されるが、特発性炎症性筋腫性生検では観察されず、異種移植片の筋繊維の一部が健康な筋繊維の大きさと同様の断面領域まで再生できることを示している。
この手順の最も重要な部分は、最初の切開が行われ、正常にエピミシウムを切断した後、足首のすべての腱を識別することです。異種移植片の機能的能力は、単一のミオファイバーを酵素的に単離し、カルシウム過渡症を試験するか、または電気刺激に続いて誘発された強制測定を行うことによって評価することができる。
