פרוטוקול זה מציג את השיטה לשיפור תפקוד הלב באופן מעברי בעכברי ניוון השרירים של דושן על ידי השתלת אקסון הנגזר מתאים מולדים מיוגניים רגילים. השתלה אקסוזומלית יכולה לשפר את תפקוד הלב בעכברי DMD בשיתוף עם ביטוי מוגבר של ניוון בלבבות המטופל. השיטה המתאימה לבידוד אקסון, טיהור והשתלת תוך-מיאוקרדיאלי תורמת להצלחת השתלת האקסון כדי לשפר את תפקוד הלב של עכברים עם ניוון השרירים של דושן.
טיפול אקסוסום נגזר MPC עשוי לשפר את תפקוד שריר השלד על ידי העברת mRNA דיסטרופין נורמלית בתתיווך אקסומוזום. סרטון זה מדגים את הטכניקות הקריטיות לטיהור אקסוסום, לידה תוך-גולגולתית אקסוקליפסאלית ואקו-קרדיוגרפיה לאחר ההשתלה. ההדגמה של אקו קרדיוגרפיה תיע נעשה על ידי יאן שן, טכנאי מהמעבדה שלנו.
כדי להתחיל בהליך זה, זרע חמישה מיליון תאים C2C12 לתוך צלחת תרבות 15 ס"מ עם 20 מיליליטר של DMEM מלא המכיל 10%FBS ואנטיביוטיקה. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן, השתמש רוטור דלי מתנדנד כדי ultracentrifuge FBS ב 100, 000 פעמים G ו בארבע מעלות צלזיוס במשך 18 שעות כדי להכין מדיום דל שומן.
להשליך את גלולה ולאסוף את על טבעי. כאשר תאי המונוליאר מגיעים ל-80% נוחות בצלחת התרבות, החליפו את ה-DMEM המלא במדיום מדולדל במיוחד. השתמש פיפטה העברה כדי לאסוף את supernatant מן צלחת תרבות התא כל 48 שעות.
צנטריפוגה הצינורות ב 150 פעמים G במשך עשר דקות כדי להסיר את התאים הנותרים. סנן את העל-טבעי באמצעות מסנן מיקרומטר של 0.22 כדי לחסל כל פסולת תא ולהעביר את המדיום המסונן לצינורות ברורים במיוחד. לאחר מכן, השתמש רוטור דלי נדנדה כדי ultracentrifuge הצינורות ב 100, 00 פעמים G וב 4 מעלות צלזיוס במשך 120 דקות כדי לזרז את exosomes.
תוכלו להתריע מחדש על גלולה המכילה אקסוזום ב-PBS ולאחר מכן למלא את כל הצינור הצלוב במיוחד ב-PBS. Ultracentrifuge השעיה זו ב 100, 00 פעמים G וב 4 מעלות צלזיוס במשך 120 דקות כדי לחסל חלבונים מזהמים. השליכו את העל-טבעי והשקיעו מחדש את גלולת האקסוזום ב-100 מיקרוליטרים של PBS.
יש לאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. ראשית, לתקן כל עכבר הרדמה במצב סופין על פלטפורמה כירורגית על ידי אבטחת כל איבר עם סרט הדבקה. מניחים תפר 3-0 אופקית מתחת לשיניים העליונות כדי להחזיק את הלסת העליונה במקום.
לאחר מכן, להחיל קרם depilatory בצד שמאל של החזה של העכבר כדי להסיר את אשוח מהעור. באמצעות קטטר מד 24, לבצע צנרור אנדוטראצ'יאלי דרך חלל הפה. ולהשתמש במכונת הנשמה מכרסמים כדי לאוורר את העכבר עם אוויר החדר בקצב של 195 נשימות לדקה.
לחטא את העור עם 70% אלכוהול ו 10% povidone יוד. ואז לעשות חתך אלכסוני 10 עד 15 מילימטר מקצה החזה השמאלי לבית השחי השמאלי. השתמש במספריים כדי לחתוך את החזה הראשי ו pectoralis קטין.
ולעשות בית חזה שמאלי דרך החלל הבין-צלעי הרביעי. הכנס בעדינות להקות מפשק כדי להפיץ את חלל בית החזה לרוחב של 10 מילימטרים דואגים לא לפגוע בריאה השמאלית. לאחר מכן, השתמש בשני פינצטה ישר כדי להסיר את pericardium.
מפרידים ביניהם ומ מניחים אותם מאחורי קצות המפשק כדי לחשוף את הלב. השתמש מחט אינסולין מד 31 להזריק גם MPC-Exo או PBS intramyocardially לתוך הקיר האחורי של החדר השמאלי באתר אחד. לאחר מכן, השתמש 6-0 תפרים ניילון כדי לסגור את חלל בית החזה, שרירי החזה, ואת העור, ברצף.
יומיים לאחר השתלת האקסוזן PBS, הרדמה את העכברים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. השתמש בקלטת כדי לתקן עכבר במצב supine ולהחיל ג'ל אקוסטי שחומם מראש על אזור החזה השמאלי. לאחר מכן, השתמש אקו לבוגרפיה כדי להעריך את הפונקציה החדר השמאלי.
להשיג את תצוגת הציר הארוך parasternal של החדר השמאלי בשני ממדים ולאחר מכן לסובב את בדיקה אולטרסאונד 90 מעלות כדי לקבל תצוגת ציר קצר החדר השמאלי ברמת שריר papillary. לאחר מכן, להקליט תמונות אקו-קרדיוגרפיות במצב M ולמדוד את הקוטר השמאלי חדרית סוף דיאסטוטלי, נפח סוף סיסטולי חדרית שמאל, נפח סוף דיאסטוטי חדרית השמאלית, ואת נפח סוף סיסטולי החדר השמאלי. יש לשלוט בקצב הלב של העכברים לפחות 400 לדקה לתפקוד מדידת הלב.
לאחר exosomes מבודדים ומטוהרים מתאים C2C12, נוכחותם מאושרת באמצעות ניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים שידור. תמונת מיקרוסקופ אלקטרוני השידור מציגה את המורפולוגיה של הויוסומים הבהירים והעיגוליים של אקסוזומים שמקורם ב- C2C12. ניתוח כתם מערבי מאשר את נוכחותם של סמני אקסוסום כולל CD63 ו- Tsg101.
אזור בצקת שקוף נצפתה לאחר הזרקת intramyocardial לתוך הקיר האחורי של החדר השמאלי של עכברי mdx אשר מציין כי הזריקה לתוך שריר הלב הוא מוצלח. כתמים Immunofluorescent עבור דיסטרופין מבוצעת לאחר מכן כדי לקבוע אם אספקת MPC-Exo לב משחזר ביטוי דיסטרופין חלבון בלבבות mdx. שחזור חלקי של ביטוי דיסטרופין נצפתה עם לוקליזציה קרום בחלק cardiomyocytes.
תפקוד הלב נמדד על ידי אקו לב יומיים לאחר הלידה תוך-מיוקרדיאלית כדי לקבוע אם התמרה של MPC-Exo משפרת את תפקוד הלב בעכברי mdx. הטיפול MPC-Exo נראה כדי לשפר את תנועת הקיר הפנימי לעומת PBS, מה שמרמז כי השתלת MPC-Exo שיפרה את תפקוד הלב בעכברים mdx. באמצעות מחט אינסולין 31 מד עם קצה בערך 20 מעלות הוא קריטי להצלחה עבור משלוח של רוב exosomes לתוך שריר הלב ומקסימום החשיפה של אקסוזומים מוזרק לארח קרדיומיוציטים.
בעקבות ההליך, ביטוי דיסטרופין ניתן לזהות לאחר הזרקת אקסוזום נגזר MPC על ידי כתמים immunofluorescent המציין כי אספקת אקסוזום נגזר MPC לב משחזר ביטוי דיסטרופין-חלבון. טכניקה זו תסלול את הדרך לטיפול קרדיומיופתיה עם חומרים גנטיים טיפוליים נושאי אקסוסום כולל DNA, mRNA, lncRNA, או microRNAs.
