このビデオでは、I型コラーゲンと2次元および3次元培養法を用いて、2種類の細胞培養基質を調製する方法を示します。この三次元培養法は、生物環境に対して考えられ、三次元培養基質を容易に調製する方法を実証することは、研究に有用である。多くの細胞型では、同じコラーゲンを用いたにもかかわらず、細胞の挙動は2次元および3次元基質間で大きく異なる。
三次元培養基質を用い、生物の細胞行動と類似した細胞挙動を容易に調べることができる。この方法は非常に簡単で、最小限の特別な試薬を必要とします。この方法が簡単に試みられるのは、3次元ゲルが壊れやすく、適切に取り扱うことが非常に重要であるため、視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。
開始するには、適切な培養培地を調製する。コラーゲンの調製を開始するには、10倍のPBS、脱イオン水、コラーゲン、96ウェル培養プレート、氷の上に空の2ミリリットルチューブを置きます。ピペットを使用して、空の2ミリリットルのチューブに1.12ミリリットルの脱イオン水を加えます。
200マイクロリットルの10倍PBSを脱イオン水に加え、チューブを数回軽く振ります。使用直前に、2ミリリットルのチューブに0.66ミリリットルのコラーゲンを加えます。軽く、素早くチューブを数回振ります。
このコラーゲン溶液の100マイクロリットルを96ウェル培養プレートの各ウェルに注ぎ、井戸の表面全体を覆うことを確認します。左右の動きを使ってプレートを軽く振ります。培養プレートを摂氏37度で1時間培養します。
次にプレートを傾けてコラーゲンのゲル化を確認し、培養プレートをクリーンベンチに移動させます。ウェルの壁に沿ってピペットを作り、150マイクロリットルのK110をゲルにそっと注ぎます。摂氏37度で1時間インキュベートします。
その後、培養プレートをクリーンベンチに移動します。細胞培養の直前に、ピペットを使用してK110を軽く廃棄する。まず、ピペットを使用して、1.5ミリリットルのチューブに1ミリモル塩酸1.2ミリリットルにコラーゲン4マイクロリットルを加え、穏やかに混ぜます。
新しい96ウェル培養プレートの各ウェルに、このコラーゲン混合物の100マイクロリットルを注ぎます。プレートを左から右に動かしてそっと振り、室温で1時間インキュベートします。この後、コラーゲン溶液を捨てます。
ピペットを使用して、PBSでそれぞれをよく洗います。培養プレートの各ウェルに1%BSAとPBSの150マイクロリットルを加え、室温で1時間インキュベートします。細胞培養の前に、1%BSA溶液を廃棄する。
まず、FEPE1L-8細胞およびK110、トリプシン、およびトリプシン阻害剤をテキストプロトコルで概説するように調製する。慎重に培養皿から培地を取り出し、ピペットを使用して0.05%トリプシンの3ミリリットルを加えます。皿を二酸化炭素インキュベーターに戻し、摂氏37度で5分間インキュベートします。
次に、10倍倍の位相コントラスト顕微鏡を使用して、培養皿の表面からの細胞剥離を確認します。トリプシン阻害剤の3ミリリットルを追加し、15ミリリットル遠心管に剥離した細胞を収集するためにピペットを使用しています。200回gで5分間遠心分離機。
この後、上清を捨て、10ミリリットルのK110でペレットを再懸濁する。10倍倍の位相顕微鏡を使って細胞を数え、K110で細胞を1ミリリットル当たり50,000細胞の細胞密度に希釈します。ウェルの壁に沿ってピペット処理を行い、培養プレートの各ウェルに細胞懸濁液の0.1ミリリットルをそっと種付けする。
適切な時間の摂氏37度で二酸化炭素インキュベーターでインキュベート。まず、テトラゾリウム塩130マイクロリットルとWST-8を1.3ミリリットルの予熱K110を2ミリリットルのチューブに混ぜます。培養プレートをクリーンベンチに移動し、ピペットを使用してK110をウェルから静かに捨てます。
K110で優しく洗い流し、非接着性の細胞。その後、各ウェルにWST-8と混合K110の110マイクロリットルを追加します。2時間摂氏37度で二酸化炭素インキュベーターでインキュベートします。
その後、培養プレートをクリーンベンチに移動します。各ウェルから100マイクロリットルのコンディション培地を収集し、新しい96ウェル培養プレートの井戸に移動します。マイクロプレートリーダーを用いて、450ナノメートルで吸光度を測定し、生存細胞数を推定する。
細胞形態は非繊維状および線維形態で観察され、ここに示されている。培養の最初の2時間では、細胞は両方の形態のコラーゲンに接着し、広がる。播種の3日後、非繊維形の細胞は広がり続け、細胞数は増加し、線維状の細胞は限られた広がりを示す。
FEPE1L-8細胞は、I型コラーゲンの非繊維状形態および未処理の皿表面上で増殖し続ける。対照的に、細胞は線維の形態で増殖しない。この手順を試みる場合、立体ゲルが非常に壊れやすいということを覚えておくことが重要です。
溶液やヒントがゲルに直接接触しないように注意する必要があります。このメソッドは、さまざまな方法で変更できます。例えば、検体の膜成分を混合するために、基質膜を模倣する細胞培養基質を作ることができる。
多くの場合、生体における細胞外マトリックスの機能は不明である。三次元培養上の細胞を培養するために、生体に類似した細胞外マトリックス成分の機能を調べることができる。3次元ゲル培養技術を適用することにより、細胞内の薬物濃度を効果的に試験することができる。
このプロトコルは、目的に基づいて、ゲル化中に他のEGM成分または成長因子を混合することによって複雑な三次元培養基質を開発するために使用することができる。
