このプロトコルは、初期段階のゼブラフィッシュエンブリからのクライオセクションにおける逐次免疫蛍光および免疫体細胞化学の新しい手順を示し、特定の細胞集団における正確な共局在化分析を可能にする。このプロトコルの主な利点は柔軟性です。単一のクライオセクションを使用して免疫蛍光と免疫組織化学の技術を組み合わせて組織形態、発現の共存、抗体の適合性を最大化します。
これらの研究者はしばしば抗体の入手可能性と同様の合併症に直面し、しばしば同様のタイプの実験を行うため、このプロトコルは他の魚や水陸両用モデルに適用することができます。初期段階の胚凍結分を扱う作業は、小さく、凍結切除は困難であり得るので難しいかもしれませんが、高度な準備と練習は、この方法の苦労を軽減するのに役立ちます。私たちのプロトコルには、特定の処理と注意が必要な複数のステップがあり、誰かがテクニックを実証するのを見ずに習得することは困難です。
開始するには、以前の固定および調製された48時間の受精後、15 25 OCT混合物を含むチューブから、混合物の任意の移動を最小限に抑える鉗子を使用してプラスチックモールドに送り込みます。約半数のモールドをOCT培地で満たし、胚を穏やかに混ぜます。ラベル付きプラスチック金型を準備し、必要な胚を空のラベル付きプラスチック金型に移し、OCT培地の持ち越しを最小限に抑えます。
その後、胚で金型の上部にOCT培地でそっと充填します。可視化のために軽いステレオ顕微鏡の下で働いて、望ましい方向の胚を整理するために針を使用する。次に、金属製のプラットフォームを備えた断熱容器に準備した金型を入れ、ドライアイスに凍らせます。
金属のプラットホームの上にそっとアイスバケツを置き、冷たい部屋を作り、約30分間凍結します。マイナス20度に設定されたクライオスタットを使用して、埋め込まれた胚を10〜12マイクロメートルの厚さのクライオセクションで切断し、顕微鏡で定期的にセクションの深さを確認して位置と組織を監視します。充電したガラススライドの上にセクションを置き、空気は一晩室温でそれらを乾燥させます。
適切な容器に入れた1X PBSでスライドを5分間3回洗浄します。湿気の多い部屋の平らな表面にスライドを置きます。スライド上に液体を保つためにセクションの輪郭を描くためにバリアペンを使用します。
セクションあたりのブロックバッファーのピペット200マイクロリットルと室温で2時間ブロックバッファーにインキュベート。一次抗体希釈液とブロックバッファーを準備し、ピペットによってよく混合します。スライドをそっと傾け、ブロックバッファを排出し、湿気の多いチャンバーに戻ります。
セクション当たりのピペット200マイクロリットルの一次抗体溶液をスライドに、ブロックバッファーの200マイクロリットルを制御として適切なセクションに置く。脱イオン水で満たされた湿気の多いチャンバーで一晩摂氏4度でスライドをインキュベートし、水分を保持するためにチャンバーの端を密封することを確認します。スライドを1X PBSで5分間、適切な容器で3回洗います。
洗浄中およびブロックバッファー中に二次抗体希釈液を調製し、ピペット処理によりよく混合します。湿気の多いチャンバーの平らな表面にスライドを置いた後、セクションごとに200マイクロリットルの二次抗体溶液を加えます。暗い温度で2次抗体溶液中のスライドを30分間インキュベートします。
適切な容器に入れた1X PBSでスライドを5分間3回洗浄します。スライドを平らな表面に置いた後、各セクションに核染色液を加え、10分間包み込みます。核染色液を排出した後、非硬化蛍光実装媒体とガラスカバースリップでスライドを取り付けます。
イメージングまで暗闇の中で4度に保つようにしてください。スライドを1X PBSの個々の容器に入れ、一晩摂氏4度で平らに保管し、蓋のスリップを緩めて緩めて、攪拌すると外れます。カバースリップを押し下げないようにするか、カバースリップを手動で取り外そうとしないでくださいが、最小限の強制移動で外れるまで待ちます。
カバースリップを取り外した後、スライドを新鮮な1X PBSで容器にそっと移します。1X PBSを取り出し、非イオン界面活性剤の0.1%を室温で5分間3回、1Xトリスバッファー食剤でスライドにインキュベートします。スライドを室温で3%過酸化水素溶液で15分間インキュベートします。
次に、スライドを平らにして、ブロックバッファを表面にドロップして追加します。スライドをそっと傾け、ブロックバッファを排出します。セクションの周りの領域を乾燥させ、湿気の多い部屋に平らにスライドを置きます。
セクションごとに200マイクロリットルの一次抗体溶液をスライドに加え、一晩摂氏4度の湿気の多いチャンバーでインキュベートします。スライドをそっと傾けて一次抗体溶液を排出し、1X TBSTで5分間2回洗浄します。次に、各セクションにバックグラウンド低減ブロッキング試薬のドロップを使用する準備ができて適用し、20分間室温で湿気の多いチャンバーでインキュベートします。
スライドをそっと傾け、ブロックバッファを排出します。慎重にセクションの周りの領域を乾燥させ、湿度の高いチャンバーに平らにスライドを置きます。二次抗体溶液を各セクションに使用する準備ができて、各セクションは、賢明なドロップし、30分間室温で湿気の多いチャンバーでインキュベートします。
スライドをそっと傾けて二次抗体溶液を排出し、1X TBSTで5分間2回洗浄します。セクションの周りの領域を乾燥させた後、スライドを平らな表面に置き、各セクションにHRP発色性基質の200マイクロリットルを加えます。基板が最初のスライドに適用されたらタイマーを開始し、室温で3分間インキュベートします。
基質溶液を排出します。スライドを1X PBSで適切な容器に短時間洗い流し、穏やかな攪拌で5分間脱イオン水で2回洗浄します。スライドを最大30秒間ヘマトキシリン染色液に入れ、それぞれ5分間3回洗浄して脱イオン水で洗浄します。
スライドをスコットの水道水を含む容器に1分間インキュベートし、再び5分間脱イオン水で洗浄します。脱イオン水で希釈し、化学フードでキシレンを希釈した一連のエタノールグレードを通してスライドを脱水します。キシレンからスライドを取り外した後すぐにトルエンベースの取り付け媒体を追加し、カバースリップを置きます。
カバースリップ中に成功を確実にするためには、スライドの片側から他方の側にゆっくりとカバースリップを下げて、組織を覆い隠す泡を防ぐことが重要です。最後に、100倍の倍率で複光顕微鏡とデジタルカメラを使用して、スライドを視覚化して画像化します。ここで使用する特異的抗体は、増殖性細胞と、積極的に増殖しているドナー細胞を同定し、定量した増殖細胞とを同時に検出する。
免疫蛍光と免疫組織化学の両方を経て、個々の細胞を正確に同定するためには、高品質の画像を生成することが不可欠です。イメージオーバーレイを実行するためにイメージ解析プログラムを使用しました。この手順を試みるとき、免疫検査中に十分に染色し、スライドに対抗することが最も重要です。
この手順の後、別の抗体の組み合わせ、組織タイプ、または種を使用するなど、元のプロトコルへの変更として追加の方法を実行することができます。画像は、関連するデータを取得するためにさまざまな方法で分析することもできます。この技術により、細胞間相互作用を調査する方法として共局化と複数の遺伝的背景を調べることができ、詳細な共局在化分析を必要とする他の技術と同様に適用することができました。
免疫検査における試薬の多くは危険であり、それに応じて治療されるべきである。エタノール、キシレン、および取り付け剛性を使用して作業は、フードで行う必要があります。DAB廃棄物は有害廃棄物として処分し、ポストDABの流れは漂白されるべきです。
